GPX

·论 著·

于国霞1，杨俊慧2，霍宏昌1，王 磊3，王 切3*

(1.河北省石家庄市妇幼保健院药剂科，河北 石家庄 050051；2.河北省井陉县医院神经内科，河北 井陉 050300；3. 河北医科大学基础医学院人体解剖学教研室，河北 石家庄 050017)

[摘要] 目的观察谷胱甘肽过氧化物酶1(glutathione peroxidase 1,GPX-1)在大鼠肝缺血再灌注损伤(hepatic ischemia-reperfusion injury,HIRI)模型的表达变化，探讨GPX-1在清除过氧化物、降低缺血再灌注诱发的过氧化损伤中的作用。方法夹闭大鼠肝中、右叶肝蒂30 min，建立大鼠HIRI模型；肝中、右叶再灌注6 h后取血和肝脏。观察血清丙氨酸转氨酶(alanine aminotransferase,ALT)活性变化，采用速率法测定；HE染色法观察大鼠肝脏形态结构变化；观察肝组织过氧化氢(hydrogen peroxide，H2O2)和丙二醛(malondialdehyde,MDA)含量变化，分别采用钼酸比色法和硫代巴比妥酸比色法测定；GPX-1的mRNA表达水平和蛋白表达水平分别采用RT-PCR和Western blotting法测定；对GPX-1表达水平与MDA含量、GPX-1表达水平与H2O2含量分别进行相关性分析。结果HIRI模型组大鼠肝组织形态结构受损明显，肝组织内H2O2和MDA含量均升高，血清ALT活性升高；肝组织内GPX-1 mRNA表达水平和蛋白表达水平均明显增强，并与肝组织内MDA含量、H2O2含量呈正相关关系。结论大鼠肝缺血再灌注后，肝组织遭受过氧化损伤；抗氧化酶GPX-1表达升高可减轻过氧化损伤。

[关键词] 再灌注损伤；谷胱甘肽过氧化物酶；过氧化氢

肝缺血再灌注损伤(hepatic ischemia reperfusion injury，HIRI)是肝脏疾病手术治疗过程中常见的并发症。HIRI的发生可引发术后肝功能不全与肝衰竭，直接影响手术成功率和术后生存率[1-4]。在肝脏手术治疗过程中，首先要阻断肝脏的血液供应，待手术完成后再重新恢复其血液供应，此即形成缺血再灌注，这样会有大量活性氧族(reactive oxygen species，ROS) 产生。ROS可通过改变细胞膜的通透性引起脂质过氧化，导致肝脏发生过氧化损伤[5-6]。因此，ROS被认为与HIRI的发生具有密切联系。谷胱甘肽过氧化物酶(glutathione peroxidase,GSH-Px)是机体重要的抗氧化酶。谷胱甘肽过氧化物酶1(glutathione peroxidase1,GPX-1)为GSH-Px家族表达最丰富的成员，存在于所有类型的细胞。GPX-1通过防止细胞内过氧化氢的有害积累等作用，在ROS平衡和应激信号传导中起着至关重要的作用[7-9]。肝脏是血液供应极为丰富的器官，对缺血缺氧的反应也极为敏感[10]。但在HIRI时肝脏GPX-1是否参与未见报道。本研究对此进行探讨。

1.1 主要试剂 提取RNA试剂Trizol，PCR扩增试剂dNTP、Taq DNA聚合酶购自Invitrogen公司。RNA-CDNA反转录试剂盒购自Promega公司。蛋白表达检测试剂：GPX-1一抗(兔抗鼠)为Abcam公司生产，GPX-1二抗(羊抗兔)为Zymed公司生产。检测丙二醛(malonaldehyde,MDA)含量、过氧化氢(hydrogen peroxide，H2O2)含量试剂盒购自南京建成科技公司。测定ALT活性试剂盒购自宁美康生物科技公司。

1.2 制备HIRI模型和组织样品采集 制备HIRI动物模型选用雄性Wistar大鼠，体重(200±10) g；12只大鼠随机分为对照组(6只)和肝缺血再灌注损伤组(HIRI组，6只)。建立大鼠HIRI动物模型[11]：腹腔注射6%水合氯醛(5 mL/kg)麻醉大鼠，常规消毒后打开腹腔寻认肝蒂，动脉夹夹闭肝右、中叶的肝蒂；30 min后松开动脉夹，恢复肝右、中叶血液供应，制备HIRI模型。对照组大鼠只游离肝蒂并不夹闭。肝右、中叶血液再灌注6 h后，右颈总动脉取血5 mL，低温离心机以3 000 r/min离心10 min,离心后采集上层血清,用于测定大鼠体内丙氨酸转氨酶(alanine aminotransferase，ALT)的活性；取部分肝组织固定于4%多聚甲醛中，用于观察其形态结构变化；其余置于液氮中，用于MDA、H2O2含量的测定，以及GPX-1表达的测定。

1.3 血清ALT活性测定 按照ALT活性测定说明书步骤测定大鼠血清中ALT的活性。

1.4 肝组织形态结构观察 采用苏木精-伊红(hematoxylin-eosin staining，HE)染色法，观察肝组织形态结构变化。修洁固定后的肝组织，约0.8 cm×0.8 cm×1.0 cm大小，经梯度乙醇脱水，二甲苯透明，随后浸蜡3 h、包埋成2.0 cm×2.0 cm×2.0 cm大小的蜡块，修块后进行连续切片，切片厚度5 μm，经37 ℃恒温水浴箱展片后裱于载玻片上，经常规HE染色操作(二甲苯脱蜡→乙醇至水→苏木精伊红染色→乙醇脱水→二甲苯透明→中性树胶封片)，在光学显微镜下观察肝组织形态结构并拍照。

1.5 肝脏MDA、H2O2含量测定 液氮冻存后的肝组织，置于-80℃冰箱中保存。首先制备肝组织匀浆：取出约黄豆大小冻存肝组织，加入零度匀浆缓冲液，冰水浴下匀浆约1.5 min，匀浆液用低温离心机4 ℃下以4 000 r/min离心20 min，采集上清即为10%肝组织匀浆液。依次测定肝脏MDA含量：取肝组织匀浆液，按照南京建成试剂盒中MDA测定使用说明步骤测定MDA含量。最后测定肝脏H2O2含量：同样取肝组织匀浆液，按照南京建成试剂盒中H2O2测定使用说明操作步骤，测定H2O2含量。

1.6 肝组织GPX-1 mRNA表达水平测定 肝组织mRNA提取：取出约绿豆大小冻存肝组织，加入1 mL TRIzol，按照TRIzol使用说明书中操作步骤提取RNA。反转录：按照说明书操作步骤将3 μg RNA反转录成cDNA。PCR过程：mRNA表达的内参照，选用3磷酸甘油醛脱氢酶(GAPDH)，GPX-1 mRNA水平的相对表达量，用GPX-1与GAPDH扩增产物灰度值之比表示。

1.7 肝组织GPX-1蛋白表达测定 采用Western blotting方法，测定肝组织内GPX-1蛋白的表达。取约黄豆大小冻存肝组织加入1 mL蛋白提取液，冰预下研磨1 min，离心后收集上清，用改良Lowry法进行蛋白定量。加入上样Buffer后煮沸变性。蛋白上样量62 μg，经SDS-PAGE凝胶电泳、半干转膜、封闭膜用5%脱脂奶粉；在膜上滴加一抗(1∶500稀释)，室温(18 ℃)静置过夜，PBS洗膜2次，加辣根过氧化物酶标记的二抗(1∶1 000稀释)。条带出现后将膜扫描，对条带进行灰度值分析，用GPX-1与GAPDH条带的灰度值之比表示GPX-1蛋白水平的相对表达。

1.8 肝组织GPX-1 mRNA和蛋白表达与MDA含量、H2O2含量相关性分析 将大鼠肝组织内MDA、H2O2含量以及与其GPX-1 mRNA和蛋白水平的相对表达，采用Pearson法进行相关性分析。

1.9 统计学方法 应用SPSS 13.0统计软件分析数据。计量资料比较采用两独立样本的t检验；相关性采用Pearson相关分析。P

2.1 大鼠血清ALT活性 大鼠血清ALT活性，对照组为(20.03±5.23) U/L，HIRI组为(87.43±9.06) U/L，HIRI组血清ALT活性明显高于对照组，差异有统计学意义(t=15.774,P=0.000)。

2.2 大鼠肝组织形态结构的观察 大鼠肝组织切片HE染色形态结构观察，光学显微镜下400倍显示：对照组大鼠肝组织形态结构规整，未见异常。HIRI组大鼠肝血窦扩张明显，扩张的血窦内可见大量红细胞，肝细胞受压萎缩，胞浆染色变浅，还可见到空泡出现，细胞核染色也变浅，并可见炎细胞浸润现象(图1，2)。

图1 对照组肝组织HE染色(×400)

Figure 1 HE staining of liver of control group (×400)

图2 HIRI组肝组织HE染色(×400)

Figure 2 HE staining of liver of HIRI group(×400)

2.3 大鼠肝组织内MDA、H2O2含量的变化 HIRI组肝组织内MDA、H2O2含量均明显高于对照组，差异均有统计学意义(P

表1 大鼠肝组织内MDA，H2O2含量Table 1 The MDA，H2O2 content in liver

组别MDAH2O2对照组 8.72±1.5315.25±2.07HIRI组12.75±2.2530.53±2.88t值3.62210.556P值0.0050.000

2.4 大鼠肝组织内GPX-1 mRNA的相对表达 HIRI组大鼠肝组织内GPX-1 mRNA表达水平(0.72±0.11)明显高于对照组(0.45±0.07)，差异有统计学意义(t=5.026，P

2.5 大鼠肝组织内GPX-1蛋白的相对表达 HIRI组大鼠肝组织内GPX-1蛋白的表达水平(0.76±0.13)明显高于对照组(0.55±0.10)，差异有统计学意义(t=3.166，P

2.6 大鼠肝组织内GPX-1 mRNA和蛋白表达与MDA、H2O2含量的相关性 大鼠肝组织内MDA、H2O2的含量与GPX-1 mRNA表达水平呈正相关关系(P2O2的含量与GPX-1蛋白表达水平呈正相关关系(P

表2 大鼠肝组织内GPX-1 mRNA和蛋白表达与MDA、H2O2含量的相关性Table 2 The Correlation between GPX-1 mRNA,protein expression and MDA,H2O2 content in rat liver

项别GPX-1 mRNAr值P值GPX-1蛋白 r值P值MDA0.6430.0240.622 0.031H2O20.7640.0040.6570.020

肝脏外科手术(如肝外伤、肝脏部分切除、肝脏移植等)治疗过程中，需要暂时阻断肝脏的血液灌注，手术完成后再恢复其血液供应，此后即可引发肝缺血再灌注损伤。临床实践证实，肝缺血再灌注损伤也是引发肝移植术后肝功能不全或衰竭，增加术后病死率的一个主要因素[12-13]。有研究表明，肝脏的血液供应被暂时阻断，其后再恢复灌注的短暂过程中，即缺氧复氧过程中，会有大量ROS产生并释放出来；ROS所诱发的过氧化损伤，是肝缺血再灌注损伤的原因之一[14-15]。肝脏是机体内重要的代谢、解毒、分泌器官，由于其对能源的高要求，在很大程度上肝脏是个依赖氧气供应的器官；因此，容易受到缺血或缺氧的影响。本研究旨在观察HIRI模型组大鼠肝组织内MDA含量、H2O2含量、抗氧化酶GPX-1 mRNA和蛋白表达水平的变化及其相关性，探讨HIRI发生后GPX-1是否会发挥抗氧化作用。

首先，笔者通过夹闭大鼠肝中、右叶的肝蒂30 min，制成HIRI动物模型。在肝脏再灌注6 h后，与对照组相比，HIRI组大鼠的肝组织形态结构已受损明显。ALT主要位于肝细胞内，肝细胞受损后血液中ALT含量升高，导致血液中单位体积内ALT的活性升高。因此，血液中ALT的活性，可以作为检验肝功能的指标。与对照组相比，HIRI组大鼠血清ALT活性明显升高，提示缺血再灌注已导致肝细胞功能明显受损。HIRI组大鼠肝组织形态结构和肝细胞功能的损伤表现，证实HIRI模型建立成功。

ROS包括H2O2、超氧阴离子等，它们代谢活跃，能与许多蛋白和脂类物质发生过氧化反应，导致细胞损伤甚至死亡[16]。H2O2因其含量丰富、形式稳定、半衰期长、可在细胞内外扩散等特点，被认为是造成过氧化损伤的主要原因[17]。因此，笔者选用肝组织内H2O2含量表示肝脏氧化应激的水平。本研究结果显示，HIRI组大鼠肝脏内H2O2含量明显升高。表明HIRI后肝组织产生了大量ROS，使其处于高度氧化应激状态。ROS能与脂类物质发生过氧化反应，MDA 是其代谢产物之一。 因此，肝组织内MDA的含量可以衡量细胞过氧化损伤的程度[18]。本研究结果显示，HIRI组大鼠肝组织内MDA含量明显升高。结合肝细胞内H2O2含量的升高，推测在HIRI发生时肝组织内有大量H2O2等活性氧族产生，它们与胞膜和胞内脂类物质发生过氧化反应产生MDA，表明肝组织此时不仅处于高度氧化应激状态，并且已遭受过氧化损伤。

氧化应激的主要特点是ROS的产生和抗氧化酶活性之间的不平衡。过量ROS的产生会对蛋白质、脂类和DNA造成氧化损伤。因此，维持活性氧平衡对细胞生长和存活至关重要。GPX-1是细胞内抗氧化体系的一种主要酶蛋白，可保护机体免受氧化损伤，它存在于细胞质和线粒体间隔中，也存在于某种细胞的过氧化物酶体内。已有研究发现，在许多生理条件下，GPX-1比过氧化氢酶更能有效保护细胞对抗细胞内过氧化物，分解H2O2和有机过氧化物，抑制H2O2诱导的DNA损伤、脂质过氧化和蛋白质降解等[19-20]。本研究结果显示，HIRI肝脏GPX-1表达升高，并且与H2O2、MDA含量呈正相关。因此，有理由推测HIRI发生时大量ROS由肝脏产生，并与脂类物质发生过氧化反应，诱发肝细胞损伤。这也与上述的肝组织形态结构和肝细胞功能受损相吻合。此时，大鼠受到刺激后上调GPx-1的表达，用以清除大量的ROS，减轻肝细胞损伤。

本研究证实，在HIRI发生时，肝脏处于氧化应激状态，并且遭受过氧化损伤；此时肝组织内GPX-1表达上调，可减轻肝细胞的进一步损伤。

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YU Guo-xia1,YANG Jun-hui2,HUO Hong-chang1,WANG Lei3,WANG Qie3*

(1.Department of Pharmacy,Shijiazhuang Maternal and Child Health Care Hospital,Hebei Province,Shijiazhuang 050051,China; 2.Department of Neurology,Jingxing County Hospital,Hebei Province,Jingxing 050300,China; 3.Department of Anatomy,School of Basic Medical Sciences,Hebei Medical University,Shijiazhuang 050017， China)

[Abstract] Objective To observe the expression change of glutathione peroxidase-1(GPX-1) in rats of hepatic ischemia-reperfusion injury(HIRI) model and investigate the role of GPX-1 in scavenging peroxide and reducing peroxidative injury induced by ischemia and reperfusion. Methods The HIRI model of rats was established by blocking the hepatic pedicle of the right and middle lobes for 30 mins. The blood and liver were taken after 6 hours of reperfusion. The activity of serum ALT was detected with rate method,the changes of liver morphology and structure in rats was observed by HE staining,the malondialdehyde(MDA) and hydrogen peroxide(H2O2 ) content in liver were determined by Thiobarbituric acid colorimetric method，and Molybdate colorimetric method respectively. The GPX-1 mRNA and protein expression level were evaluated by RT-PCR and Western blotting respectively,the correlation between the GPX-1 expression level and the MDA content,between the GPX-1 expression level and the H2O2 content were analyzed. Results Compared with the rats of control group,the morphological structure of liver of HIRI group was significantly damaged,the serum ALT activity,the content of MDA and H2O2 in the liver of HIRI model were significantly increased,the mRNA and protein expression level of GPX-1 in liver were also significantly enhanced,There were positive correlation between GPX-1 mRNA and MDA,between GPX-1 pretein and MDA,between GPX-1 mRNA and H2O2,between GPX-1 pretein and H2O2. Conclusion Ischemia and reperfusion causes liver tissue to be in oxidative stress and been subjected to peroxidative damage. Antioxidant enzymes GPX-1 may play an antioxidant stress role by scavenging peroxides during the process,and reduce hepatic peroxidative injury induced by ischemia-reperfusion.

[Key words] reperfusion injury; glutathione peroxidase; hydrogen peroxide

doi：10.3969/j.issn.1007-3205.2019.01.003

[中图分类号]R619.9

[文献标志码]A

[文章编号]1007-3205(2019)01-0007-05

[收稿日期]2018-03-12；

[修回日期]2018-05-10

[基金项目]河北省医学科学研究重点课题(20180693)

[作者简介]于国霞(1977-)，女，河北赞皇人，河北省石家庄市妇幼保健院主管中药师，医学学士，从事临床药学研究。

*通信作者。E-mail:[email protected]

(本文编辑：刘斯静)