耐热木霉菌株筛选及其对热作区香蕉促生效应的研究

香蕉是热带亚热带地区最重要的水果之一。我国不仅是香蕉消费大国，更是重要的香蕉主产国。农民习惯性大量施用化肥，导致土壤酸化逐渐严重，进而加剧了香蕉枯萎病的发生[1]。由于土壤结构不良，土壤肥力下降、土壤微生物群落失衡等引发的香蕉枯萎病导致我国香蕉种植面积锐减，已经严重影响我国香蕉的种植生产[2–3]。

木霉菌是自然界广泛分布的一类具有较高生防应用价值的真菌[4]，其能产生多种酶类物质和次生代谢产物，促进植物生长、提高土壤肥力，拮抗多种土传病原菌[5]。但在自然条件下，木霉菌株的生长易受到光照、温度、湿度及化学药剂等环境因子的影响。不同种类木霉的生物学特性差异较大，甚至同种的不同菌株间也有很大的差异。在室内或者田间土壤环境中，土壤微生物都不可避免地受到逆境因子的干扰。木霉受温度等环境条件的影响较大[6]，有研究表明28–30 ℃是木霉菌生长的最适温度[7]，而热作区表层土壤温度较高，因此从热作区土壤中筛选耐热的木霉菌株具有重要意义。生物有机肥是在腐熟堆肥的基础上添加特定的功能微生物(如芽孢杆菌、木霉等)制备而成[8]。相比于化肥，生物有机肥的营养元素更加丰富，在改良土壤结构、提高肥料利用率和改善农产品品质等方面发挥重要作用[9–10]。因此，研究耐热木霉菌研制成的生物有机肥对热区作物的生长和抗病效果具有重要意义。

本实验室从温带气候区域筛选得到的贵州木霉NJAU4742具有广谱抑菌特性，其研制的木霉生物有机肥对番茄、辣椒等作物具有较好的抗病及促生效果[11–12]。但该菌株不耐高温，其研制的木霉生物有机肥在热区的实际使用效果存在不确定性，因此本研究拟从热作区土壤中分离筛选适温范围较宽的功能木霉菌株，并进一步通过病原菌对峙试验、不同温度下生长速度及酶活力测定筛选耐热木霉菌株，并通过田间试验评估木霉菌株研制的生物有机肥对热作区香蕉的抑病及促生效果，以期为热作区农业生产提供技术储备与理论指导。

筛选菌株土壤样品采自海南省省乐东黎族自治县多处连作香蕉园，密封于自封袋，带回实验室置于4 ℃保存待用。

木霉选择性培养基：每L孟加拉红培养基中抗生素氯霉素0.25 g，3% (M/V)链霉素3 mL，五氯硝基苯0.20 g，曲拉通1 mL，于倒平板前加入到三角瓶中。

孟加拉红培养基(g/L)：蛋白胨5，葡萄糖10，磷酸二氢钾1，硫酸镁0.50，琼脂20，孟加拉红0.03，氯霉素0.10，蒸馏水1 L。

PD培养基(g/L)：马铃薯200，葡萄糖20，自来水1 L，pH自然。

PDA培养基：PD培养基中加入20 g琼脂。

贵州木霉NJAU4742 (Trichoderma guizhouense NJAU4742)和尖孢镰刀菌古巴转化型4号生理小种(Fusarium oxysporum f. sp. cubense tropical race 4，FOC 4)，由江苏省固体有机废弃物资源化高技术研究重点实验室提供。

称取不同蕉园土壤样品各5 g置于含有45 mL无菌水的100 mL三角瓶中，制备土壤悬液，梯度稀释后吸取100 μL土悬液涂布于木霉选择性平板上。28 ℃培养2 d后，在平板上挑选形态各异的菌落，用无菌接种环蘸取分离得到的木霉菌丝于PDA平板上，待菌落直径长到2–4 cm时再次转接到新的PDA平板上，直至得到纯的真菌菌落。将纯化后的木霉菌株接种于PDA平板中心，分别放置于20、28、35、40 ℃培养箱中培养，筛选出在20、28、35、40 ℃均能正常生长的木霉菌株。将初筛获得的木霉菌株接入30%甘油管中，–80 ℃冰箱保存待用。

在无菌条件下，用直径为9 mm的打孔器在木霉PDA平板上打孔取样，用镊子小心将菌饼移接入新鲜PDA平板(9 cm)中心，分别放置于20、28、35、40 ℃培养箱中恒温黑暗培养，48 h后采用十字交叉法测量菌株菌丝生长直径。

将木霉菌株与病原菌FOC 4接种到PDA培养基上，28 ℃条件下培养7 d。在无菌条件下，用直径为5 mm打孔器分别在木霉和病原菌的培养基上打孔取样，用镊子小心将菌种分别移接入新鲜PDA培养基中，两者各距培养皿边缘2 cm，以单独接种FOC 4病原菌的平板作为对照，分别在20、28、35、40 ℃恒温培养箱中黑暗倒置培养6 d。每个对峙试验设3个重复。6 d后量病原菌对照的半径和对峙培养中病原菌指向木霉菌的半径并计算抑制率。抑制率(%)=(对照组菌落半径–处理组菌落半径)/对照组菌落半径×100。

将木霉菌株在20、28、35、40 ℃条件下恒温黑暗培养4 d后，利用Solarbio纤维素酶(CL)活性检测试剂盒、β-1, 3葡聚糖酶(β-1, 3-GA)活性检测试剂盒、几丁质酶活性检测试剂盒、过氧化物酶(POD)活性检测试剂盒测定菌株酶活活力。

将筛选所得的木霉菌株接种至PD培养基中，进行液体发酵，发酵温度为28 ℃，摇床转速为170 r/min，发酵时间为96 h，得到木霉发酵液。经镜检，每mL发酵液中木霉孢子数大于1×107个。100 g (干重)秸秆与200 mL水混匀后并加入6.6 mL氨基酸，均匀搅拌后于115 ℃灭菌1 h。冷却后，接入20 mL上述制备好的木霉发酵液，28 ℃培养7 d，以浅盘法发酵[13]制得木霉固体菌种。经镜检，每g (干重)固体木霉菌种中含木霉孢子数为5×109个。将木霉固体菌种按10% (W/W)的比例接种于普通有机肥中，制成木霉生物有机肥。经涂布计数检测，试制而成的每g (干重)木霉生物有机肥含木霉活菌数为6×108个CFU。

供试酸解氨基酸由江苏省江阴市联业生物科技有限公司提供，其含16.9%的总氨基酸、10.2%的游离氨基酸，含氮(N) 4.6%、磷(P2O5) 0.4%、钾(K2O) 0.07%。供试普通有机肥购自江苏省江阴市联业生物科技有限公司，普通有机肥及试制的木霉生物有机肥养分含量一致，有机质均为45%，均含氮(N) 1.5%、磷(P2O5) 2.5%及钾(K2O) 1.3%。

田间试验于2018年7月至2019年6月在海南临高县新盈农场进行。供试果园土壤为红壤，基本土壤理化性状如下：pH值5.7，速效磷含量86 mg/kg，速效钾含量350 mg/kg，铵态氮含量6.45 mg/kg，硝态氮含量16.45 mg/kg。选取地势较为平坦且吸芽长势相一致的地块进行试验，同一田块中随机划分不同小区进行处理，小区内选取吸芽长势较为一致的进行肥料处理。

本试验共设置以下4个处理(表 1)：(1)不施肥对照(CK)，不施肥；(2)化肥处理(CF)，只施化肥；(3)普通有机肥处理(OF)，施用8 kg普通有机肥处理；(4)木霉生物有机肥处理(T-BIO)，施用8 kg木霉生物有机肥处理。各处理等养分设置，每株香蕉全生育期施肥养分总量为N 0.3 kg、P2O5 1.8 kg、K2O 0.8 kg。除基肥所施用肥料种类不同外，各处理养分及追肥所用肥料一致。每个处理3个重复，每个重复选定20株香蕉吸芽进行肥料实验，其中小区内部10株作为产量及枯萎病发病率监测的统计区域，其余吸芽为保护行。供试农场所种香蕉品种为“巴西蕉”，实验季为宿根蕉第三茬，定芽后种植密度为每亩160株。2018年7月，于上一茬香蕉收获1个月后施入底肥，每株香蕉基肥除施入50 g复合肥(15-15-15)外，依各处理施入相对应的有机肥及木霉生物有机肥。对照用化肥补齐养分差，具体施肥信息见表 1。供试化肥中氮肥为尿素(N为46.4%)，磷肥为过磷酸钙(P2O5为18%)，钾肥为硫酸钾(K2O为52%)。其他农事操作与果园日常操作一致。于2019年6月香蕉收获期进行发病率、产量及品质测定。

于香蕉收获期调查各处理的香蕉枯萎病发病率。将出现黄叶、叶片萎蔫、假茎开裂并呈褐色开裂等典型枯萎病症状的香蕉植株和母株早已病死而重新发出吸芽苗的香蕉植株，均统计为发病植株，发病率为发病香蕉株数占定殖香蕉总株数的百分比[14]。

于2019年6月留芽茬香蕉收获期采收时，各处理选定长势一致、最具有代表性的6株健康香蕉，测定其果实重量，依据各处理平均单株质量和能收获的健康香蕉株数估算香蕉总产量。

各个处理随机挑取6个健康成熟香蕉果实，测定果实的可食率；切取其中间部位，测定果实中的可溶性固形物、维生素C、可溶糖和蛋白质的含量。可食率的测定参照张江周等[15]的方法；可溶性固形物含量的测定参照张劲等[16]的方法；维生素C含量的测定采用高效液相色谱法[17]；还原糖含量的测定采用蒽酮比色法[18]；蛋白质含量的测定采用考马斯亮蓝G-250染色法[19]。

于2019年6月留芽茬香蕉收获时，各处理随机选择3株健康香蕉，每株香蕉在滴水线附近用土钻随机钻取4个土样，收集距地表 10–15 cm处土样，土样混合后放入自封袋于实验室自然晾干后用于土壤理化性质测定。

土壤理化性质测定参照土壤农化分析[20]，包括土壤pH、速效钾、速效磷、铵态氮和硝态氮含量等指标。利用玻璃电极酸度计测定水土比为5:1 (W/V)的土壤悬液即为土壤pH值；利用碳酸氢钠-钼蓝比色法测定土壤速效磷(Available P，AP)；利用醋酸铵-火焰光度计法测定土壤速效钾(Available K，AK)；0.01 mol/L氯化钙溶液浸提土壤后用流动分析仪测定土壤铵态氮(NH4+-N)及硝态氮(NO3–-N)。

采用ITS及tef分子双标记鉴定筛选所得木霉菌株的分类信息。将该功能菌株接种于新鲜PDA培养基上，28 ℃培养3 d后刮取木霉菌丝体，利用OMEGA真菌DNA提取试剂盒提取菌株DNA。用ITS和tef引物扩增菌株ITS及tef基因片段进行分子鉴定。ITS扩增引物分别为ITS1 (5′-AGAAGTCGTAACAAGGTTTCCGTAG G-3′)和ITS4 (5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′) tef扩增引物为EF1H (5′-ATGGGTAAGGAAGAC AAGAC-3′)和EF2T (5′-GGAAGTACCAGTGATC ATGTT-3′)[21–22]。扩增条件参照原始文献，扩增产物送由南京擎科生物科技有限公司测序。将测序所得ITS及tef基因序列与GenBank数据库进行Blast比对分析，获取参考序列及相关分类信息。

采用Excel 2007和SPSS 22.0软件进行数据统计分析，使用单因素方法分析(ANOVA)进行数据比较，最小显著差异法(Least Significant Difference，LSD)检验进行多重比较(P < 0.05)。采用R语言corrplot绘制相关系数矩阵热图。采用Mr Bayes v3.2.6构建系统发育树。

结合不同温度条件下木霉菌株的生长情况，初步筛选获得4株木霉菌株(MD8、Li2C、JS11、JS84)，其在20–40 ℃均能生长。由表 2可知，对照菌株NJAU4742在35 ℃生长缓慢，在40 ℃无法生长。20 ℃时，菌株NJAU4742相比于其他4株初筛木霉菌株菌落直径较大；28 ℃和35 ℃时，菌株Li2C、JS11、JS84菌落直径较大，其中菌株JS84数值上最大；而在40 ℃时，相比于其他4株木霉菌株，菌株JS84菌落直径显著大于其他菌株。

平板对峙实验结果表明，初筛的4株木霉菌株及对照菌株对尖孢菌FOC 4均具有拮抗作用(图 1)。20 ℃下菌株NJAU4742、MD8、Li2C、JS11及JS84对FOC 4抑制率分别为51.05%±0.23%、44.40%±0.36%、48.39%±0.42%、47.46%±0.34%及49.73%±0.23%；28 ℃下抑制率分别为47.19%± 0.41%、45.24%±0.48%、47.14%±0.48%、45.71%±0.82%及47.62%±0.48%；35 ℃和40 ℃下FOC 4无法生长。在20 ℃下，菌株NJAU4742对FOC 4的抑制率最高，其次为菌株JS84；而在28 ℃下，菌株JS84对FOC 4的抑制率最高。

由图 2可知，不仅不同菌株间产酶活力有差异，同一菌株在不同温度下产酶活力也有差异。对照菌株NJAU4742在40 ℃无法产生酶活。在40 ℃下，菌株JS84产纤维素酶活和β-1, 3葡聚糖酶活显著高于其他菌株。在20 ℃、28 ℃和35 ℃下，5株木霉菌株产纤维素酶活无显著性差异。在35 ℃下，菌株JS84产几丁质酶活力显著高于其他菌株；在20 ℃和40 ℃下，菌株LI2C和菌株JS84产几丁质酶活力显著高于其他菌株。在28 ℃下，菌株JS84产过氧化物酶活力显著高于其他菌株，在20 ℃、35 ℃和40 ℃下虽无显著差异。与28 ℃真菌最适生长温度下产酶活力相比，菌株LI2C和菌株JS84在20 ℃低温、35 ℃和40 ℃高温条件下刺激产几丁质酶酶活力增强；菌株JS84在35 ℃和40 ℃高温条件下刺激产纤维素酶和β-1, 3葡聚糖酶酶活力增强。

由图 3可知，施用生物有机肥能够显著降低香蕉枯萎病的发生。与不施肥处理CK和化肥处理CF相比，木霉生物有机肥JS84处理和4742处理均显著降低了香蕉枯萎病的发病率，且JS84处理的发病率最低。

JS84处理的产量显著高于不施肥对照、化肥处理、有机肥处理及木霉生物有机肥处理4742，分别增产32%、18%、8%和6% (图 4)。

由表 3可知，与不施肥对照相比，施用有机肥及木霉生物有机肥处理均能显著增加香蕉果实可食率，而处理间无显著差异。JS84处理的维生素C含量显著高于不施肥对照、有机肥处理及4742处理，分别增加了24%、15%和9%；可溶性固形物含量、还原糖及总蛋白含量显著高于不施肥对照、化肥处理及有机肥处理，而与4742处理无显著差异。

由表 4可知，即使在仅有一季的时间内，不同施肥处理对于连作蕉园土壤的理化性状影响不同。施用有机肥及生物有机肥处理的土壤pH值、速效磷、速效钾、铵态氮及硝态氮含量均显著高于化肥处理及不施肥对照；相比于有机肥处理，木霉生物有机肥处理显著增加了速效磷、速效钾及硝态氮含量。除硝态氮含量外，木霉生物有机肥处理间各土壤理化性状无显著差异。

由图 5可知，香蕉枯萎病发病率与菌株几丁质酶及过氧化物酶呈显著负相关关系。菌株过氧化物酶与土壤中各理化性质及香蕉果实品质各指标均呈显著正相关关系。菌株几丁质酶活性与土壤理化性状中速效钾、速效磷、硝态氮及品质指标中可食率、维生素C、可溶性固形物、还原糖和蛋白质呈显著正相关关系。菌株β-1, 3葡聚糖酶与土壤理化性状中pH值、速效钾、速效磷、铵态氮及品质指标中可食率、维生素C、还原糖和蛋白质含量呈显著正相关关系。

ITS序列构建的系统发育树分析表明，菌株JS84属于肉座菌目肉座菌科木霉属(图 6-A)；tef1序列构建的系统发育树表明(图 6-B)，菌株JS84位于Trichoderma citrinoviride分支上，其与模式菌株Trichoderma citrinoviride TUCIM 6016 (JGI1133928)相近。进一步结合菌株的形态特征，将菌株JS84归类为桔绿木霉(Trichoderma citrinoviride)，相关核酸序列提交至NCBI保存，其登录号为MT210518。

本研究从海南蕉园土壤中分离筛选得到4株耐热木霉菌株，在20–40 ℃下均能生长，其中菌株JS84在35 ℃和40 ℃下生长速度最快。本研究发现所筛选的4株耐热木霉菌株及本实验前期筛选的具有广谱抑菌能力的木霉菌株NJAU4742均能拮抗尖孢镰刀菌FOC 4的生长。其中可在40 ℃仍能生长的木霉菌株JS84在20 ℃和28 ℃下菌株对FOC 4的抑制率可达64%和66%。本研究结果与先前研究一致，表明木霉菌株可作为抑制尖孢菌的潜在优异生防菌株[23]。本研究还发现在40 ℃下，菌株JS84产纤维素酶活和β-1, 3葡聚糖酶活性显著高于其他菌株，在20 ℃、35 ℃和40 ℃逆境下，菌株JS84产几丁质酶活显著高于菌株NJAU4742，表明菌株JS84在不同温度下具有较强的酶活性。平板抑菌能力、几丁质酶和β-1, 3葡聚糖酶产生能力对于木霉菌防治植物病害具有一定的重要性[24]。因此，综合以上指标，选择菌株JS84进行进一步研究。

王瑾等[25]研究发现施用生物有机肥能有效地降低香蕉枯萎病的发病指数并具有较好的防效。本研究中木霉生物有机肥的施用能显著降低香蕉枯萎病发病率。重寄生作用是木霉主要的抑菌机制，木霉可通过分泌葡聚糖酶、几丁质酶、纤维素酶、蛋白酶等物质降解细胞壁，控制植物病害的发生[26]。相比于实验室具有广谱抑菌能力的木霉NJAU4742研制的生物有机肥，从热区分离获得的耐热木霉JS84研制的生物有机肥抑制土传枯萎病的效果更优。木霉生物有机肥的施用还可显著提高土壤的速效磷、速效钾以及硝态氮含量等养分供应水平。与本研究结果相似，张金妹等[27]研究发现施用生物有机肥能够有效改善蕉园土壤理化性质，提高土壤肥力，促进香蕉高产优质。木霉生物有机肥的施用对于土壤肥力的改善可能不仅是菌株分泌的有机酸活化所致，可能还与其调控了土壤微生物区系，提升了土壤总体生物肥力等因素相关[11]。此外，木霉生物有机肥JS84的施用还有效提高了香蕉的产量及果实品质。巩子毓等[28]研究发现施用生物有机肥能够有效增加黄瓜的产量，提高果实品质，增强果实风味。李瑞霞等[29]发现施用木霉生物有机肥能够提高番茄产量，改善番茄果实品质以及改善土壤肥力。生物有机肥中对于产量的提升及果实品质的提升与木霉生物有机肥中功能菌株的直接促生抗病及施用后对于土壤微生物的间接调控密切相关。

综上所述，本试验分离筛选获得一株能在20–40 ℃下生长，产酶活能力较强并对作物有生防能力的耐热木霉菌株，根据ITS和tef1基因序列分析，鉴定菌株JS84为桔绿木霉菌(Trichoderma citrinoviride)。田间试验结果表明菌株JS84试制的生物有机肥对香蕉具有显著的促生和防病效果。木霉菌株JS84适应温度范围更广、综合性能更佳，这为热区农业可持续发展及优良微生物菌株资源利用提供了参考价值。