模式识别受体概述

先天免疫系统是宿主抵御病原微生物的第一道防线，并依赖于种系编码受体，也称为模式识别受体（PRR）[1,2,3]。这些受体识别在微生物上表达的分子特征，称为病原相关分子模式（PAMPs），以及在受损宿主细胞上表达的分子基序，称为损伤相关分子模式（DAMPs）[1,2,3]。PRR与PAMP和DAMP的相互作用可导致促炎细胞因子和其他免疫调节分子的表达 （图 1）[1,2,3]。PRR主要由抗原呈递细胞（APC）表达，包括树突状细胞和巨噬细胞，但它们也被发现在其他免疫细胞和非免疫细胞上表达[2,4]。

在哺乳动物的几种不同类型PRR中，Toll样受体（TLR）得到了相当广泛的研究 [2,4,5]。其他模式识别受体包括RIG-I样受体（RLR）、Nod样受体（NLR）、AIM2样受体（ALR）和C型凝集素受体（CLR），以及cGas和其他细胞内DNA传感器（图 1） [6,7,8]。这一概述主要为PRR的TLR和RLR类别。  

图 1.先天免疫细胞（如树突状细胞和巨噬细胞）识别出各种病原体[2, 3, 4]。这些免疫细胞表达模式识别受体（PRR），它们能够识别病原诱导的感染是通过某些蛋白质和其他分子基序（称为病原相关分子模式（PAMP）和损害相关分子模式（DAMP）），而PAMP和DAMP分别是在病原体和受损宿主细胞上发现的[2, 3]。模式识别受体包括Toll样受体（TLR）、核苷酸结合的寡聚结构域样受体（Nod样受体，简称NLR）和C型凝集素受体（CLR）[6, 8]。

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Toll样受体在先天免疫系统中发挥重要作用，主要是识别病原相关分子模式 [1,2,4,5]。Toll样受体由树突状细胞（DC）、巨噬细胞和非免疫细胞（如纤维原细胞）表达。Toll样受体可以根据其细胞位置进行分类[2,3,4]。人的TLR家族由10个成员组成（TLR1-TLR10），而小鼠TLR家族有12个成员（TLR1-TLR9, TLR11-TLR13）。细胞表面TLR包括TLR1、TLR2、TLR4、TLR5、TLR6和TLR10，并都有胞外的结构域 [2,3,4]。胞内TLR包括TLR3、TLR7、TLR8、TLR9、TLR11、TLR12和TLR13，它们位于内质网（ER）、内体和溶酶体中 [2,6,7]。细胞表面TLR识别细菌膜成分，如脂质、脂蛋白和蛋白质，而细胞内TLR主要识别核酸[8,9]。TLR识别的PAMP部分清单，见表 1。

TLR被认为是I型跨膜蛋白，由一个N端配体识别域、一个单次跨膜域和一个C端信号域组成[10]。TLR的胞外域包含一段基序的串联拷贝，也称为富含亮氨酸重复结构（LRR），负责识别PAMP[10]。TLR的细胞内信号域与IL-1受体同源，被称为Toll/interukin-1受体（TIR）域[10]。这个信号域是发起下游信号通路所必需的10。TLR激活相关的两个主要信号通路包括MyD88依赖通路和TRIF依赖通路（图 2） [10]。  

图 2.病原通过TLR在APC上激发的信号通路。像TLR1这样的细胞表面TLR具有胞外域，而像TLR3这样的细胞内TLR是位于胞内的 [2, 6, 10]。同源或异源二聚体的形成能够诱导下游信号通路，主要是MyD88依赖通路或者TRIF依赖通路[10]。TLR的下游通路引起促炎细胞因子的表达，包括白细胞介素-6（IL-6）、IL-8、IL-12和肿瘤坏死因子alpha（TNFα）[10]。

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虽然胞内检测TLR RNA有助于抗病毒免疫，但是RLR对于多数RNA病毒的免疫识别和应答至关重要 [11,12]。RLR主要识别单链RNA和双链RNA（ssRNA和dsRNA）。RLR家族的受体成员可以在所有细胞类型的细胞质中找到，并且由RIG-I（retinoic acid-inducible gene I）、MDA5（melanoma differentiation-assoicated gene 5）和LGP2（laboratory of genetics and physiology 2）组成 [13,14]。当出现病毒感染或存在细菌RNA时，RIG-I和MDA5能够诱导产生I型干扰素（IFN）和趋化因子。

RLR通常由两个N端半胱天冬酶募集域（CARD）、一个中心DEAD盒解旋酶/ATPase域和一个C端调节域组成 [12,13,14]。LGP2不含CARD域，因此其对下游抗病毒信号的影响可能是因为LGP2与dsRNA病毒配体的作用或与其他RLR（RIG-I和MDA5）的相互作用产生的。RLR位于细胞质中，能够识别dsRNA病毒的基因组RNA，也能识别ssRNA病毒复制中间体产生的dsRNA [15,16]。在IFN I型刺激或病毒感染的应答中，RLR的表达大幅增强 [13,14,15]。病毒RNA刺激RIG-I或MDA5表达相关的CARD域，这些域与K63多泛素链聚集成CARD四聚体，然后结合并激活衔接分子MAVS。MAVS募集TBK-1，TBK-1磷酸化IRF3，最终诱导I型干扰素基因的转录 [13,14,15]。  

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PRR通路对于建立抗微生物感染的有效防御是不可或缺的。一些研究调查了微生物病原体与其影响先天免疫系统之间的关系 [17,18]。

Qureshi 等人研究了小鼠对细菌脂多糖（LPS）的应答 [17,18]。他们的数据显示，对LPS应答的调节位于小鼠4号染色体上编码TLR4的 Lps 位点。这项研究确定TLR4是宿主对致病性LPS应答的关键调节分子 [17,18]。           

Oosting 等人研究了TLR1/TLR2异二聚体之间的关系和它们对包柔氏螺旋体属的应答[19]。TLR2的一个重要特征是它可以与TLR1和TRL6形成异二聚体 [19]。尽管TLR2被认为是包柔氏螺旋体属的主要受体，但有证据表明TLR1和TLR6发挥了作用[19]。TLR1和TLR6基因敲除小鼠被分别暴露于包柔氏螺旋体中。TLR1基因敲除小鼠表现出干扰素γ的表达增加，这与TLR6基因敲除小鼠相反，后者不能产生明显的干扰素γ应答。在两个敲除品系之间的促炎细胞因子中没有显著变化[19]。  

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TLR是病原体检测中至关重要的传感器，因此识别和表征免疫细胞表面的TLR表达对于研究病毒清除的细胞机制具有重要意义。流式细胞仪通常是分析免疫细胞TLR谱的首选方法。

一般来说，整个细胞群用活性染料染色，然后用TLR特异性荧光抗体进行免疫标记。为了对单细胞悬液中的所有活细胞进行染色，用磷酸盐缓冲盐水（PBS）冲洗一次，并以1×106个/mL重悬于染色缓冲液中，如Invitrogen Bioscience流式染色缓冲液。接下来，向细胞悬液中加入1 µL活性染料，如 Invitrogen可固定活性染料。然后将细胞在室温或冰上避光培养30分钟，用1 mL PBS冲洗一次，并重悬在100 µL染色液中。

TLR1、TLR2、TLR4、TLR5、TLR6和TLR10，这些TLR在细胞表面有胞外域，因此可直接用荧光抗体识别目标TLR（或光谱兼容的荧光抗体）对细胞染色（图 3，表2）。细胞在冰上培养30分钟，用染色缓冲液冲洗，然后重悬在300 µL染色液中。可以用流式细胞仪进来分析细胞，如Invitrogen Attune NxT 流式细胞仪。如果上样前需要固定细胞，可以使用固定缓冲液，如Invitrogen eBioscience 胞内固定缓冲液。在短暂培养后，将细胞冲洗并重悬于染色缓冲液中，再上样到流式细胞仪。

TLR3、TLR7、TLR8、TLR9、TLR11、TLR12和TLR13，这些细胞内TLR的抗体染色，细胞必须固定并破膜，使抗体与抗原接触。细胞已经免疫标记了细胞表面抗原，如上所述再进行固定，并使用破膜缓冲液进行破膜，如 Invitrogen eBioscience破膜缓冲液。完成固定和破膜后，细胞与识别相关TLR的荧光抗体试剂（或光谱相容的其他荧光抗体）一起培养 （表2）。细胞与抗体在冰上培养 30 分钟，用破膜缓冲液冲洗一次，用染色缓冲液冲洗一次，然后重悬于300 µL染色缓冲液中。重新悬浮后，可以通过流式细胞仪来分析细胞。

由于免疫细胞上高密度的Fc受体，背景荧光可能是个问题 [4]。我们建议使用未标记阻断抗体，如人类细胞的Invitrogen Fc Receptor Binding Inhibitor Polyclonal Antibody，或小鼠细胞的 Invitrogen CD16/CD32 Monoclonal Antibody （clone 93） 和Invitrogen Normal Rat Serum。

在检测核内靶标中，例如NF-κB和其他转录因子的抗体标记（表2），我们建议使用Invitrogen eBioscience FoxP3/转录因子染色缓冲液来固定和破膜这些细胞（在上一步骤可能免疫标记了细胞表面抗原）。在固定和破膜后，细胞与一个或多个荧光抗体共同培养，这些荧光抗体能够识别这些转录因子。细胞在冰上培养30分钟，用FoxP3/转录因子染色缓冲液的破膜缓冲液冲洗一次、用染色缓冲液冲洗一次，然后重新悬浮于300 µL染色缓冲液中。重新悬浮后，可以通过流式细胞仪来分析细胞。  

图 3.使用10 µL（0.5 µg）Invitrogen TLR7单克隆抗体，PE标记（Clone: 4G6，Cat. No. MA5-16249）（红色）和0.5 µg小鼠 IgG1同型对照（绿色）对1 x 106人类BDCM（具有 DC 形态的B细胞）中的TLR7进行流式胞内分析。

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