二维相关红外光谱及其应用

　　1  引言

　　二维相关光谱是一种实验设计与数据处理相结合的分析技术。对于每一种样品体系，需要根据研究目的，设计合适的实验方案，通过对样品施加特定的微扰(包括机械拉伸力、温度、压力、浓度、磁场、光照等)，诱导光谱信号产生动态变化，对一系列的动态谱图进行相关分析计算，便得到二维相关谱图(图1)。二维相关谱图反映的是样本中各种组成成份或者微观结构单元相应于外界微扰的变化情况，以及这些变化之间相互的联系。目前应用最广泛的是以温度为变量的二维相关红外光谱技术。

　　2  二维相关光谱的特性

　　二维相关光谱可用三维立体图或二维等高线图进行可视化显示，便于直观地对二维信息进行解析。在二维相关光谱的等高线图中，z坐标轴值用x-y平面中的等高线表示。同步相关光谱代表两个动态红外信号之间的协同程度，它是关于主对角线对称的。相关峰在对角线和非对角线区域均会出现。在对角线上有一组峰，它是动态红外信号自身相关而得到的，所以称为自动峰。自动峰总是正峰，它的强度代表外扰引起的变化程度。强的自动峰对应于动态谱中强度变化较大的区域，而保持不变的区域则显示出非常小或没有自动峰，这与微观环境对官能团运动的影响是密切相关的。在二维相关图中(见图1)，以圆圈的个数代表Φ(ν1,ν2)的绝对值。在坐标(A,A)，(B,B)，(C,C)和(D,D)处的自动峰分别具有2，1，4和2个圆圈，表明(C,C)处的自动峰最强，而(B,B)处的自动峰最弱。

　　二维同步相关光谱中位于主对角线以外的峰叫做交叉峰，它显示扰动发生过程中ν1和ν2处的强度变化的相关变化。为了便于观察自动峰和交叉峰的强度的相关变化，可以构造一个相关正方形，把对角线上的自动峰和两侧的交叉峰连贯起来。所以A和C，B和D是同步相关的(图1a)。交叉峰的符号既可为正也可为负。如果发生在ν1和ν2处的强度变化是同一方向的，那么Φ(ν1,ν2)为正；反之，如果发生在ν1和ν2处的强度变化是沿着相反方向的，那么Φ(ν1,ν2)为负。

图1 二维光谱（a）同步 （b）异步

　　异步光谱代表两个动态红外信号的光谱强度变化顺序。与同步光谱不同的是，异步光谱是主对角线反对称，没有自动峰，完全是由对角线两侧交叉峰组成(图1b)。但可用一对反对称的交峰和对角线上相应的点绘制异步相关正方形。异步交叉峰的产生是由于两个光谱峰的强度变化存在相对的加速度，这种特性可帮我们区分重叠在一起的起源不同的峰。

　　在一维动态光谱中，因靠得太近而重叠在一起的两个吸收峰，如果是来自不同的官能团，就有可能在二维异步相关光谱中呈现为两个明显的独立峰。二维异步相关分析常用来提高光谱的分辨率，系统中的不同化学组成、相同化学成分的不同相、同相中相同化学成分的不同官能团，在外部干扰下都可能有非同步的响应，从而产生异步相关峰。

　　异步交叉峰的符号可以是正的，也可以是负的(用阴影表示)，可以帮助指认亚分子官能团的变向运动次序，这有助于研究官能团间化学相互作用的机理和动力学。如果当同步相关光谱对应位置的强度为正（Φ(ν1,ν2)＞0）时，正的异步交叉峰（ψ(ν1,ν2)＞0）表示ν1处的强度变化总是先于ν2处的强度变化，负的表示ν1处的强度变化总是滞后于ν2处的强度变化；当Φ(ν1,ν2)＜0时，上述规则正好相反。

　　3  应用

　　二维相关谱学反映的是由外界扰动(如温度、压力、浓度等)引起的光谱变化的细微特征，将吸收峰在第二维的尺度上展开，从而提高光谱分辨率，有可能区分在一维光谱上被覆盖的小峰和弱峰，从而提高光谱的解析能力。另外，二维相关谱学还可以提供以下信息：通过谱峰之间相关性来分析分子内部与分子之间的相互作用；检测光谱强度的变化次序，能有效地对化学反应过程和分子振动的动力学过程进行详细的研究；可以在不同类型的光谱之间(如红外和拉曼光谱)进行相关性分析，从而获得通常光谱所不能获得的信息。

　　二维红外相关光谱在药物、聚合物、蛋白质、生物学等领域取得了成功的应用，如应用于聚合物材料的结构性能研究，生物蛋白质的次级结构研究，化学反应的反应机理探讨和动力学研究，中草药成分的鉴定区别等。我国在中药二维相关光谱方面做了大量的工作，编辑出版了《中药二维相关红外光谱鉴定图集》，并将温度变化的二维相关红外图谱用于中药鉴别、质量控制和中药变质的机理研究等。

　　其中一个典型的实例是将二维相关红外光谱用于“清开灵”中药针剂的质量检测。清开灵注射剂的主要成分为牛黄、水牛角、黄芩、金银花、栀子等，具有清热解毒、化痰通络、醒神开窍的功效，对于热病身昏、中风偏瘫等疾病有很好的临床效果。图2是清开灵变质前后的红外光谱，两光谱的主要吸收峰非常相近，无法分辨。

图2 清开灵变质前后的红外光谱

　　图3和图4分别是清开灵变质前后的变温二维相关红外光谱，温度变化范围为30～150℃，间隔20℃。变质前的二维红外同步光谱中出现大量相关峰，可以发现，1611 cm-1实际上是由1572 cm-1，1667 cm-1和1729 cm-1三个吸收峰组成。这三个吸收峰互相关联，且1729 cm-1吸收峰的热敏性与其它两个吸收峰相反。这些吸收峰分别是生物碱、黄酮衍生物、其它羰基化合物吸收引起的。在其异步光谱的信息中，1667 cm-1变化要比1572 cm-1快而比1729 cm-1慢。对比图3和图4可以看出，变质后与未变质的二维红外光谱区别非常明显，变质后的同步光谱中没有发现自动相关峰1667 cm-1和交叉峰(1417 cm-1，1667cm-1)，因此推断室温下清开灵的变质主要是因为黄酮的氧化引起。与此同时，与1059 cm-1吸收峰相关的交叉峰也减少了，1059 cm-1是糖苷类物质的特征吸收峰。由此可知，针剂的变质主要是黄酮氧化和糖苷热降解导致。而异步光谱中则主要观察到1729 cm-1，1667 cm-1，1572 cm-1，1417 cm-14组对温度比较敏感的吸收峰的相互变化关系。显然，将二维相关红外光谱结合模式识别技术可实现药品的自动识别，以及其他类似的应用场合，这将是今后该技术的主要研究方向之一。

图3 清开灵变质前的二维相关红外光谱 （a）同步相关（b）异步相关

图4 清开灵变质后的二维相关红外光谱 （a）同步相关（b）异步相关