从零开始的科研之旅之一

本人医学研究僧一枚，目前处于三不管状态：导师不管、女票不管（因为根本没有/捂脸）、家里人不管。想想自己入师门爬坑多年（没人带），也该造福一下师弟师妹了，不过这个系列会不会继续更，我也不确定。

为什么要电泳检测RNA完整性？

现在做医学科研实验的，逆转录PCR应该是绕不过去的坎，实时定量PCR（qPCR）也算是新人进实验室的入门实验了，但是周围人好像就把抽提的RNA测个浓度、OD值就去逆转录跑荧光定量了？什么？课题组钱多多！好吧，你赢了。

为什么是非变性？

因为只是看看RNA完整性，不需要像测定分子量那么精确，跑出来的条带其实大多是核糖体RNA；还有，变性要加甲醛的噢，甲醛要放危险品柜的，这种有毒有害的，拿出来放回去还麻烦的我统统不要。

好了，正文开始：

• 实验前准备

材料：Trizol（TRIzol、RNAiso PLUS啥的都可以）提取的真核生物的总RNA（只有Total RNA才会有条带），RNase-free Water（稀释RNA用的）。

器具准备：制胶模具、电泳仪，核酸电泳槽，电子天平，移液器，枪头，微波炉，UV凝胶成像仪等。 

试剂准备：琼脂糖，1XTAE 电泳缓冲液（1XTBE电泳缓冲液也行），Gel-Red染料（替代EB的，这玩意儿致癌），6X DNA上样缓冲液。

• 操作步骤

1. 用蒸馏水将制胶模具和梳子冲洗干净，放在水平桌板上，晾干（据说器具照照紫外线RNA不容易降解，但是谁让我懒呢）；

2. 配制1%(~1.2%)浓度的琼脂糖凝胶：准确称量0.5g琼脂糖干粉，加入到配胶用的100ml锥形瓶内，倒入1XTAE电泳缓冲液50ml（注意比例哦）；

3. 放入到微波炉内加热至溶液澄清（微波炉 中高火1.5min-2min，当心暴沸，建议一开始加热30s拿出来晃匀，然后每10s左右晃匀一下直至溶液澄清）。待胶冷却至60~70 ℃，加入2.5ul Gel-Red（具体加多少按说明书比例算），轻轻旋转以充分混匀凝胶溶液；将胶液倒入制胶模中，在适当位置处插入梳齿，室温下30分钟左右后凝胶完全凝结，小心拔出梳子，将凝胶安放在电泳槽内，注意上样孔朝黑色负极侧；

4. 向电泳槽中倒入电泳缓冲液（一定要新鲜配制的，跑过半定量PCR产物电泳的绝对不可以），其量以没过没过胶1mm为宜，如果样品孔内有气泡，尽可能除去；

5. 待检测RNA样品中加入6×DNA上样缓冲液（即每10μl样品加2μl loading buffer，其实我上样缓冲液用的是Beyotime的D0081，DNA Marker是Beyotime的D0117S，制胶的时候就不必加染料了）混匀后，用移液枪将样品混合液缓慢加入被浸没的凝胶加样孔内（上样量大约1000-1800ng RNA，最好不要低于500ng），最左侧孔内加入5μL DNA Marker（这里更正一下，加入DNA Marker是可行的，RNA Marker非常难买，而且好像比较贵）；

7. 接通电源，红色为正极，黑色为负极，使RNA 样品由负极往正极泳动。一般120V 电压，电泳15~20min 即可；

8. 电泳完毕，关上电源，在UV凝胶成像仪上观察电泳条带。

• 结果分析：

UV凝胶成像之后可以看到3条带，从上往下依次是28S、18S和5S，28S rRNA条带的强度应当大致为18S rRNA条带的两倍且没有涂抹样条带，这样才能继续往下做RT-PCR，部分降解的RNA样品电泳条带会弥散，上样孔内有点亮亮的通常为基因组DNA，如果很明显的话，一定要用DNase去除，否则有可能影响后续实验结果。

先给个结果示意图：

下面是我第一次跑的结果：

左边6个泳道是最近抽提的RNA，右边7个泳道是室温隔夜的（忘记放-70℃冰箱了），第一次做上样量、电压都没调好，但是右边肯定是降解了的。

偷偷地告诉你，如果你提取的总RNA完整性很好的话，28S rRNA条带的亮度接近18S rRNA条带的3倍！

给你看看某公司跑的条带 ↓

这样下来毕业大论文的第一张实验结果图就有了，只要再来这么十几张就可以顺利毕业啦，哈哈！