单细胞分析的 Python 包 Scanpy（图文详解）

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单细胞分析的 Python 包 Scanpy（图文详解）

2024-05-30 12:57| 来源: 网络整理| 查看: 265

文章目录一、安装二、使用1、准备工作2、预处理过滤低质量细胞样本3、检测特异性基因4、主成分分析（Principal component analysis）5、领域图，聚类图（Neighborhood graph）6、检索标记基因7、保存数据8、番外一、安装

如果没有conda 基础，参考： Conda 安装使用图文详解（2021版）

代码语言：javascript复制pip install scanpy conda install -y -c conda-forge leidenalg二、使用1、准备工作代码语言：javascript复制# 载入包 import numpy as np import pandas as pd import scanpy as sc # 设置 sc.settings.verbosity = 3 # 设置日志等级: errors (0), warnings (1), info (2), hints (3) sc.logging.print_header() sc.settings.set_figure_params(dpi=80, facecolor='white') # 用于存储分析结果文件的路径 results_file = 'write/pbmc3k.h5ad' # 载入文件 adata = sc.read_10x_mtx( './filtered_gene_bc_matrices/hg19/', # mtx 文件目录 var_names='gene_symbols', # 使用 gene_symbols 作为变量名 cache=True) # 写入缓存，可以更快的读取文件2、预处理

显示在所有细胞中在每个单细胞中产生最高计数分数的基因

代码语言：javascript复制sc.pl.highest_expr_genes(adata, n_top=20, )

image.png过滤低质量细胞样本

过滤在少于三个细胞中表达，或一个细胞中表达少于200个基因的细胞样本

代码语言：javascript复制sc.pp.filter_cells(adata, min_genes=200) sc.pp.filter_genes(adata, min_cells=3)

过滤包含线粒体基因和表达基因过多的细胞

线粒体基因的转录本比单个转录物分子大，并且不太可能通过细胞膜逃逸。因此，检测出高比例的线粒体基因，表明细胞质量差（Islam et al. 2014; Ilicic et al. 2016）。

表达基因过多可能是由于一个油滴包裹多个细胞，从而检测出比正常检测要多的基因数，因此要过滤这些细胞。

代码语言：javascript复制adata.var['mt'] = adata.var_names.str.startswith('MT-') # 将线粒体基因标记为 mt sc.pp.calculate_qc_metrics(adata, qc_vars=['mt'], percent_top=None, log1p=False, inplace=True) sc.pl.violin(adata, ['n_genes_by_counts', 'total_counts', 'pct_counts_mt'], jitter=0.4, multi_panel=True)

image.png

生成的三张小提琴图代表：表达基因的数量，每个细胞包含的表达量，线粒体基因表达量的百分比。

过滤

代码语言：javascript复制sc.pl.scatter(adata, x='total_counts', y='pct_counts_mt') sc.pl.scatter(adata, x='total_counts', y='n_genes_by_counts')

image.png

过滤线粒体基因表达过多或总数过多的细胞，也就是红框标识的样本。

代码语言：javascript复制# 获取线粒体基因占比在 5% 以下的细胞样本 adata = adata[adata.obs.pct_counts_mt < 5, :] # 获取表达基因数在 2500 以下的细胞样本 adata = adata[adata.obs.n_genes_by_counts < 2500, :]3、检测特异性基因

归一化

代码语言：javascript复制# 归一化，使得不同细胞样本间可比 sc.pp.normalize_total(adata, target_sum=1e4) sc.pp.log1p(adata)

存储数据

将 AnnData 对象的 .raw 属性设置为归一化和对数化的原始基因表达，以便以后用于基因表达的差异测试和可视化。这只是冻结了 AnnData 对象的状态。

代码语言：javascript复制adata.raw = adata

识别特异性基因

代码语言：javascript复制# 计算 sc.pp.highly_variable_genes(adata, min_mean=0.0125, max_mean=3, min_disp=0.5) # 绘制特异性基因散点图 sc.pl.highly_variable_genes(adata)

image.png

获取只有特异性基因的数据集

代码语言：javascript复制# 获取只有特异性基因的数据集 adata = adata[:, adata.var.highly_variable] # 回归每个细胞的总计数和表达的线粒体基因的百分比的影响。 sc.pp.regress_out(adata, ['total_counts', 'pct_counts_mt']) # 将每个基因缩放到单位方差。阈值超过标准偏差 10。 sc.pp.scale(adata, max_value=10)4、主成分分析（Principal component analysis）

通过运行主成分分析 (PCA) 来降低数据的维数，可以对数据进行去噪并揭示不同分群的主因素。

代码语言：javascript复制# 绘制 PCA 图 sc.pl.pca(adata, color='CST3')

image.png

检查单个 PC 对数据总方差的贡献，这可以提供给我们应该考虑多少个 PC 以计算细胞的邻域关系的信息，例如用于后续的聚类函数 sc.tl.louvain() 或 tSNE 聚类 sc.tl.tsne()。

代码语言：javascript复制sc.pl.pca_variance_ratio(adata, log=True)

image.png5、领域图，聚类图（Neighborhood graph）

使用数据矩阵的 PCA 表示来计算单元格的邻域图。为了重现 Seurat 的结果，我们采用以下值。

建议使用 UMAP ，它可能比 tSNE 更忠实于流形的全局连通性，因此能更好地保留轨迹。

代码语言：javascript复制sc.pp.neighbors(adata, n_neighbors=10, n_pcs=40) sc.tl.umap(adata) # 如果设置了 adata 的 .raw 属性时，下图显示了“raw”（标准化、对数化但未校正）基因表达矩阵。 sc.pl.umap(adata, color=['CST3', 'NKG7', 'PPBP'])

image.png

为了绘制缩放矫正的基因表达聚类图，需要使用 use_raw=False 参数。

代码语言：javascript复制sc.pl.umap(adata, color=['CST3', 'NKG7', 'PPBP'], use_raw=False)

image.png

目前还没有计算出各个细胞类群，下面进行聚类

Leiden 图聚类

代码语言：javascript复制# 计算 sc.tl.leiden(adata) # 绘制 sc.pl.umap(adata, color=['leiden'])6、检索标记基因

先计算每个 leiden 分群中高度差异基因的排名，取排名前 25 的基因。

默认情况下，使用 AnnData 的 .raw 属性。

T-test

最简单和最快的方法是 t 检验。

代码语言：javascript复制sc.tl.rank_genes_groups(adata, 'leiden', method='t-test') sc.pl.rank_genes_groups(adata, n_genes=25, sharey=False)

image.png

Wilcoxon rank-sum

Wilcoxon rank-sum (Mann-Whitney-U) 检验的结果非常相似，还可以使用其他的差异分析包，如 MAST、limma、DESeq2 和 diffxpy。

代码语言：javascript复制sc.tl.rank_genes_groups(adata, 'leiden', method='wilcoxon') sc.pl.rank_genes_groups(adata, n_genes=25, sharey=False) # 保存这次的数据结果 adata.write(results_file)

逻辑回归

代码语言：javascript复制sc.tl.rank_genes_groups(adata, 'leiden', method='logreg') sc.pl.rank_genes_groups(adata, n_genes=25, sharey=False)

使用逻辑回归对基因进行排名 Natranos et al. (2018)，这里使用多变量方法，而传统的差异测试是单变量 Clark et al. (2014)

image.png

除了仅由 t 检验发现的 IL7R 和由其他两种方法发现的 FCER1A 之外，所有标记基因都在所有方法中都得到了重现。

Louvain Group

Markers

Cell Type

IL7R

CD4 T cells

CD14, LYZ

CD14+ Monocytes

MS4A1

B cells

CD8A

CD8 T cells

GNLY, NKG7

NK cells

FCGR3A, MS4A7

FCGR3A+ Monocytes

FCER1A, CST3

Dendritic Cells

PPBP

Megakaryocytes

根据已知的标记基因，定义一个标记基因列表供以后参考：

代码语言：javascript复制marker_genes = ['IL7R', 'CD79A', 'MS4A1', 'CD8A', 'CD8B', 'LYZ', 'CD14', 'LGALS3', 'S100A8', 'GNLY', 'NKG7', 'KLRB1', 'FCGR3A', 'MS4A7', 'FCER1A', 'CST3', 'PPBP']

载入数据

代码语言：javascript复制# 使用 Wilcoxon Rank-Sum 测试结果重新加载已保存的对象 adata = sc.read(results_file)

获取聚类分组和分数

代码语言：javascript复制result = adata.uns['rank_genes_groups'] groups = result['names'].dtype.names pd.DataFrame( {group + '_' + key[:1]: result[key][group] for group in groups for key in ['names', 'pvals']}).head(5)

image.png

Group 1 与 Group 2 比较，进行差异分析

代码语言：javascript复制sc.tl.rank_genes_groups(adata, 'leiden', groups=['0'], reference='1', method='wilcoxon') sc.pl.rank_genes_groups(adata, groups=['0'], n_genes=20)

image.png代码语言：javascript复制sc.pl.rank_genes_groups_violin(adata, groups='0', n_genes=8)

image.png

Group 0 与其余组的比较进行差异分析

代码语言：javascript复制adata = sc.read(results_file) sc.pl.rank_genes_groups_violin(adata, groups='0', n_genes=8)

image.png

跨类群比较基因

代码语言：javascript复制sc.pl.violin(adata, ['CST3', 'NKG7', 'PPBP'], groupby='leiden')

image.png

根据已知的细胞标记，注释细胞类型

代码语言：javascript复制new_cluster_names = [ 'CD4 T', 'CD14 Monocytes', 'B', 'CD8 T', 'NK', 'FCGR3A Monocytes', 'Dendritic', 'Megakaryocytes'] adata.rename_categories('leiden', new_cluster_names) sc.pl.umap(adata, color='leiden', legend_loc='on data', title='', frameon=False, save='.pdf')

image.png

可视化每个类群的标记基因

气泡图显示：

代码语言：javascript复制sc.pl.dotplot(adata, marker_genes, groupby='leiden');

image.png

小提琴图显示

代码语言：javascript复制sc.pl.stacked_violin(adata, marker_genes, groupby='leiden', rotation=90);

image.png7、保存数据

保存压缩文件

如果只想将其用于可视化的人共享此文件，减少文件大小的一种简单方法是删除缩放和校正的数据矩阵。

代码语言：javascript复制adata.write(results_file, compression='gzip')

保存为 h5ad 数据

代码语言：javascript复制adata.raw.to_adata().write('./write/pbmc3k_withoutX.h5ad')

读取使用 adata = sc.read_h5ad(’./write/pbmc3k_withoutX.h5ad’)

导出数据子集

代码语言：javascript复制# 导出聚类数据 adata.obs[['n_counts', 'louvain_groups']].to_csv('./write/pbmc3k_corrected_louvain_groups.csv') # 导出PCA数据 adata.obsm.to_df()[['X_pca1', 'X_pca2']].to_csv('./write/pbmc3k_corrected_X_pca.csv')8、番外

我之前在处理较多数据量的时候，会有些地方不一样，具体每个数据集的处理也会有比较大的自由度，比如：

在检测线粒体基因时，这里在质控时，已经把线粒体基因直接剔除。

image.png

在做 UMAP 时，可以看到一些类群间的联系和轨迹。

image.png

做 TSNE时，可以看到类群间比较干净利索，整体比较“饱满”。

image.png

其他 Scanpy 的使用教程： scanpy 单细胞分析包图文详解 01 | 深入理解 AnnData 数据结构

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