科研

编译：刘宁，编辑：十九、江舜尧。

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血管组织存在于人体所有器官中，参与了组织发育、新陈代谢、炎症等各种生理活动，但对其单细胞的异质性了解甚少。随着基于液滴的大规模并行单细胞测序和分析技术的不断发展，单细胞RNA测序（scRNA）报道了多个小鼠器官中细胞类型的单细胞图谱。然而，血管细胞异质性以及细胞亚群对血管功能的影响尚未报道。本研究利用将小鼠的4条主动脉酶解成单个细胞（>10000个）进行scRNA测序，鉴定细胞亚群并分析相关基因的表达，同时分析了这些细胞对高脂饮食的响应变化。本研究绘制了整个主动脉细胞图谱，通过整合每个细胞中超过1900个基因的表达，更好的表征了主动脉细胞的一致性，为各种血管疾病相关的细胞亚群的研究点奠定了基础。

论文ID

原名：Single-Cell Analysis of the Normal Mouse Aorta Reveals Functionally Distinct Endothelial Cell Populations

译名：正常小鼠主动脉的单细胞分析揭示了功能不同的内皮细胞群

期刊：Circulation

IF：23.054（一区）

发表时间：2019.5.31

通讯作者：Rajat Gupta

通讯作者单位：哈佛大学医学院附属布莱根妇女医院

DOI号：10.1161/CIRCULATIONAHA.118.038362

实验设计

结果

1 正常主动脉的单细胞分布及划分细胞类型的标志物的鉴定

使用基于液滴的大规模平行scRNA测序转录分析了4种野生型C57/BL6小鼠主动脉。以低测序深度（17000 reads/细胞）对2个主动脉进行测序，以高测序深度（145000 reads/细胞）对2个主动脉进行测序。基于测序深度，簇状细胞群体的数量没有差异，所有后续分析使用的是高测序深度数据，大约检测到6200个细胞，每个细胞1900个基因（图1）。在分析之前去除了表达基因计数>4000或 2的所有基因（图1D）。其中与其他细胞簇相比，单核细胞具有最多的差异表达基因。

进一步划分：第一种标志物在某一细胞簇的所有细胞的>75％中表达，平均标准化表达>0.75，例如Myh11（VSMC）、C1qa（单核细胞）和Pecam1（EC），代表了最特异性和最敏感的标志物。第二种标志物物在细胞簇中差异表达但对此细胞簇的所有细胞不敏感，例如Gpihbp1（ECs）和Cd52/Rac2（单核细胞）。第三种标志物物是在一种细胞簇中高表达但在其他细胞簇中也高表达的基因。

与仅使用少量典型的细胞类型特异性标志物相比，利用所有基因对细胞进行聚类更好的检测细胞亚群和细胞异质性。

2 利用转录组确定主动脉细胞簇的细胞亚群

通过聚类定义的10个独立组定义主动脉细胞类型内的亚群（图2A）。成纤维细胞、单核细胞/巨噬细胞和EC都聚集成多个亚群（图2B），VSMC占所有细胞的39％，聚集成1个亚群，表达典型的VSMC标志物Myh11和Cnn1。成纤维细胞占所有细胞的33％可以分为两个亚组：高表达Pdgfra和胶原蛋白/胶原蛋白结合蛋白（Col1a1，Col1a2，Dcn，Lum）以及低表达与VSMC相关的收缩蛋白（Myh11，Cnn1）。Cdh5为标志物的EC分为3个不同的亚群，但是某些典型的EC特异性基因，例如von Willebrand因子（Vwf）和血管内皮生长因子受体（Flt1，Kdr）在不同亚群中表达差异，不能用作识别主动脉中所有EC的有效标志物。免疫细胞分为3个广泛定义的组：巨噬细胞（H2-Ab1）和2个单核细胞亚群（均表达Lyz2）。基因表达存在重叠，必须使用多种标志物物来区分。一小部分细胞表达了神经元的标志物，包括Mbp和Cnp，可能来自邻近神经元组织的少量污染。其中3个EC簇是离散的亚群，而两个成纤维细胞簇存在连续的梯度变化（图2C）。

之前在大脑的小血管中定义的早期基因标志包括Fos、Fosb、Jun和Junb等在本研究中发现具有相似的表达量，表明其并不是EC和成纤维细胞中细胞异质性的解释。为了探索每个细胞的最小测序reads数，本研究还在深度更低的scRNA测序文库中进行了细胞类型的聚类和鉴定（每个细胞约≈17000个读数），得到数据基本相同。

图2.从单细胞RNA测序鉴定的细胞类型内的亚群。

A，t-随机邻近嵌入（t-SNE）分析得到10个簇。 

B，树状图总结了主动脉细胞亚群之间的相似性。

C，鉴定每个细胞亚群的标志物的热图。 

3 三个EC亚群具有不同的基因表达谱及不同的功能

ECs是通过典型标志物物Cdh5确定的，用Wilcoxon ranksum分析进一步发现了新的标志物（图3）。包括血管生成中已知的内皮特异性参与者，包括Sdpr、Egfl7、Ptprb和Ecsc以及先前在EC和几种粘附和转运分子（Cldn5 、Icam2 、Slc9a3r2）。使用Wilcoxon秩和检验和Bonferroni校正，通过最高差异表达来定义每个亚群的唯一标志物（图4A）。最大的种群（EC 1）是由许多典型的EC标志物（Vcam1）和高表达在EC中具有已知功能的其他基因（例如Clu、Gkn3和Eln）。第二个EC群体（EC 2）表达参与脂质转运的基因（Cd36，Fabp4，Lpl和Gpihbp1）和血管生成标志物（Flt1）。EC 3群体表达淋巴管内皮细胞的标志物Lyve1。

图3.内皮细胞（EC）分为3个不同的种群。

A，t-随机邻近嵌入（t-SNE）分析EC亚群。与所有其他主动脉细胞相比，这3个EC亚群具有独特的转录谱。

B，小鼠主动脉中所有VE-钙黏着蛋白阳性细胞的t-SNE图。重新标识了3个亚群以及少量（5％）的细胞群体，这些群体是基于液滴的单细胞RNA测序的伪像。

C，多个基因显示EC特异性表达，并在所有3个EC亚群中表达。 与所有其他细胞相比，在所有EC簇中表达的遗传标志物分为血管生成EC标志物基因和粘附/转运EC标志物基因。小提琴图的y轴显示了标准化的转录表达值。

每个亚群的特征是独特的转录因子谱（图4B）。为了表征这些基于转录因子的信号网络对亚群身份的贡献，使用TRRUST数据库鉴定了每个转录因子激活的已知靶标。EC2显示Pparg激活基因的表达明显更高（图4C），与该亚群中Pparg和其他脂质处理基因的更高表达一致。EC亚群中多种转录因子及其靶标的差异表达表明其不同的功能特性。

图4.内皮细胞（EC）亚群的基因表达特征。

A，每个EC亚群具有特异性表达的前20个基因。点图显示了表达每个基因的细胞百分比（点大小）和表达水平（点颜色）。

B，EC亚群的转录因子的差异表达。

C，过氧化物酶体增殖物激活受体-γ（PPAR-G）在EC 1和EC 2亚群中的表达。*** Mann–Whitney U检验P