一种松材线虫内寄生真菌Esteyavermicola的快速培养方法与流程

本发明涉及一种松材线虫内寄生真菌esteyavermicola的大米培养基制作及培养方法。

背景技术：

松材线虫病又称松树萎蔫病，是松树的一种毁灭性流行病，能引起松林的快速枯萎死亡，对森林资源造成了严重的伤害，给国民经济造成了极大的损失，是全球性的检疫性病害。松材线虫病致病因子为松材线虫(bursaphelenchusxylophilus)，并通过人为因素和媒介天牛等进行传播扩散。

目前，主要从其病原松材线虫和传播媒介松墨天牛(monochamusalternatus)两个方面来对松材线虫病进行防治，实行预防为主，结合物理、化学和生物防治进行综合治理，但均未能真正控制和拔除疫区。目前国内外对松材线虫的生物防治主要是利用植物性杀线虫活性物质和生防微生物来实现。

松材线虫内寄生真菌esteyavermicola，又称伊氏线虫真菌和蠕虫埃斯特菌，是第一个记录的松材线虫内寄生真菌，对松材线虫表现出高侵染性和寄生率，具有作为抗松材线虫病的生物防治剂的前景和潜力。目前，应用esteyavermicola进行松材线虫病防治受到越来越多的关注。

松材线虫内寄生真菌esteyavermicola的分生孢子有两种类型，分别是杆状孢子和月形孢子，利用内寄生真菌防治松材线虫，主要是靠真菌esteyavermicola的月形孢子寄生于松材线虫表面并侵染线虫，最后消解线虫。

目前，主要培养松材线虫内寄生真菌esteyavermicola的方法有pda固体培养和pdb液体培养，但这些方法存在的问题是：产孢量少、保存时间短、易受到污染、培养成本高。

因此，非常有必要改进现有的松材线虫内寄生真菌培养方法，进而获得高产量、高密度、高质量的松材线虫内寄生真菌esteyavermicola孢子悬浮液。

技术实现要素：

本发明提供的一种松材线虫内寄生真菌esteyavermicola快速培养方法，不仅缩短了该菌的培养时间，还能获得高纯度、高密度的真菌孢子悬浮液，应用于松材线虫病的防治，具有广阔的应用前景。

本发明提供的一种松材线虫内寄生真菌esteyavermicola的快速培养方法，主要通过以下步骤实现的。

培养基配置

大米培养基组成为：大米∶灭菌水∶酵母粉∶kh2po的重量体积比为1∶(0.8～1.25)∶(0.005～0.015)∶(0.0005～0.0015)、自然ph值。

培养基接种培养

将培养基于191～121℃下灭菌20～30min，之后将灭菌后的培养基在室温下冷却至室温，接着于超净工作台上进行接种操作，首先在培养好真菌esteyavermicola的pda培养基上加入适量灭菌水，之后用涂步棒轻刮平板表面的菌落，将得到的真菌液倒入大米培养基中，用搅拌棒搅拌使其混合均匀，用封口膜封好，于26℃恒温培养箱中培养3-4天，出现菌丝。

真菌esteyavermicola孢子悬浮液制备

待真菌长好，加入不同量的灭菌水，用搅拌棒搅拌均匀，获得不同浓度孢子悬浮液。

孢子悬浮液过滤

用尼龙布套住普通塑料漏斗口，将得到的孢子悬浮液倒入漏斗过滤，将菌丝过滤掉，得到菌液。

本发明实现松材线虫内寄生真菌esteyavermicola的实验室大量培养，不仅可以大量生产菌液，而且还可用于大量生产孢子粉，保存时间更长，运输更方便，具有显著的生态效益和社会效益。

附图说明

图1是大米培养基的制备过程；

图2是将培养基进行灭菌；

图3是在超净工作台进行大米培养基接菌；

图4是在大米培养基上长好的菌；

图5是过滤好的真菌esteyavermicola菌液；

图6是在显微镜下观察到的大米培养基米粒上长满真菌esteyavermicola菌丝；

图7是在显微镜下观察到的真菌esteyavermicola月形孢子；

图8是实例1用大米培养基培养真菌esteyavermicola，该菌总孢子浓度随着培养时间增加而变化图；

图9是实例1用大米培养基培养菌月形孢子占孢子总数比例变化；

图10配方一培养真菌esteyavermicola12天孢子浓度；

图11配方一培养真菌esteyavermicola12天孢子萌发率；

图12配方一培养真菌esteyavermicola19天孢子萌发率；

图13是实例2用大米培养基培养真菌esteyavermicola，该菌总孢子浓度随着培养时间增加而变化图；

图14是实例2用大米培养基培养菌月形孢子占孢子总数比例变化；

图15配方二培养真菌esteyavermicola12天孢子浓度；

图16配方二培养真菌esteyavermicola12天孢子萌发率；

图17配方二培养真菌esteyavermicola19天孢子萌发率；

图18液体培养真菌esteyavermicola7天孢子萌发率；

图19液体培养真菌esteyavermicola14天孢子萌发率.

具体实施方式

以下结合附图实施例对本发明作进一步描述。

实施例1

本实施例提供一种真菌esteyavermicola的培养基，其制备方法如下：

大米培养基配方一组分为：大米50g、蒸馏水50ml、酵母粉0.5g、kh2po40.05g、自然ph值。

称取50g糙米，倒置500ml锥形瓶；接着称取酵母粉0.5g、kh2po40.05g，一并倒入含有50g大米的锥形瓶内；最后倒入50ml灭菌水；轻轻摇晃锥形瓶，使内容物混合均匀；本实例共制作3瓶培养基。将已配置好的培养基置于灭菌锅中，在121℃条件下灭菌20min。

取真菌esteyavermicola的新鲜斜面培养物制备成菌液。接种于上述培养基。将灭完菌的培养基在室温下冷却15min，接着于超净工作台上进行接种操作，首先在培养好生防菌esteyavermicola的pda培养基上加入适量灭菌水，之后用涂步棒轻刮平板表面的菌落，获得菌液。

大米培养基培养真菌。将得到的真菌液倒入大米培养基中，用搅拌棒搅拌使其混合均匀，用封口膜封好，于26℃恒温培养箱中培养。

制备孢子悬浮液并计算孢子浓度。从培养菌的第3日开始，每日从每瓶锥形瓶中取出50粒大米，装于50ml离心管内，加灭菌水至加满离心管，然后于涡旋振荡器中震荡1min，取上清液200ml于血球计数板上计数孢子浓度和月形孢子比例，取3瓶培养基每日总孢子浓度平均值和每日月形孢子比例平均值分别作图。随着培养时间延长，真菌总孢子浓度不断上升，并且于第七天孢子浓度达到最高，孢子浓度达到4×107个/ml左右(图8和图9)；从开始培养后的第三天，月形孢子占孢子总数比例最高，达到53％左右。此培养方法可在短时间内获得高浓度松材线虫生防菌esteyavermicola孢子，用于林间实验。

测定真菌esteyavermicola孢子萌发率。将上述3瓶大米培养菌培养12天，每瓶培养基挑取一定量的大米，加入50ml的0.05％吐温80溶液，震荡2min，用6层无菌纱布过滤德孢子悬浮液，计算孢子浓度如下图10，统一配置1×107个/ml的孢子悬浮液1ml，往pda平板上加入200ul，用涂布棒涂抹均匀，每瓶培养基做3次重复。在26℃恒温箱培养24h后，将平板放置于显微镜底下观察，每个平板取5个视野，孢子萌发率取五个视野孢子萌发率平均值，每瓶培养基真菌esteyavermicola孢子萌发率取三次重复试验孢子萌发率平均值。结果如图11所示，配方一大米培养基培养真菌esteyavermicola孢子12天后，接种于pda培养基，在26℃恒温箱培养了24h后，三瓶培养基孢子萌发率都达到90％以上。继续培养至第十九天，结果如图12所示，编号3培养基内孢子萌发率依然能达到86％左右。

实施例2

本实施例提供一种真菌esteyavermicola大米培养基新配方，其制备方法如下：

大米培养基配方二组分为：大米50g、蒸馏水50ml、自然ph值。

称取50g糙米，倒置500ml锥形瓶，倒入50ml灭菌水；轻轻摇晃锥形瓶，使内容物混合均匀；本实例共制作3瓶培养基。将已配置好的培养基置于灭菌锅中，在121℃条件下灭菌20min。

取真菌esteyavermicola的新鲜斜面培养物制备成菌液。接种于上述培养基。将灭完菌的培养基在室温下冷却15min，接着于超净工作台上进行接种操作，首先在培养好生防菌esteyavermicola的pda培养基上加入适量灭菌水，之后用涂步棒轻刮平板表面的菌落，获得菌液。

大米培养基培养真菌。将得到的真菌液倒入大米培养基中，用搅拌棒搅拌使其混合均匀，用封口膜封好，于26℃恒温培养箱中培养。

制备孢子悬浮液并计算孢子浓度。从培养菌的第3日开始，每日从每瓶锥形瓶中取出50粒大米，装于50ml离心管内，加灭菌水至加满离心管，然后于涡旋振荡器中震荡1min，取上清液200ml于血球计数板上计数孢子浓度和月形孢子比例，取3瓶培养基每日总孢子浓度平均值和每日月形孢子比例平均值分别作图。从培养的第三天至第十天，随着培养时间延长，真菌总孢子浓度不断上升，并且于第十天孢子浓度达到最高，孢子浓度达到3×10^7个/ml左右(图13、图14)；从开始培养后的第三天，月形孢子占孢子总数比例最高，达到54％左右。

测定真菌esteyavermicola孢子萌发率。在26℃将上述3瓶大米培养菌培养12天，每瓶培养基挑取一定量的大米，加入50ml的0.05％吐温80溶液，震荡2min，用6层无菌纱布过滤德孢子悬浮液，计算孢子浓度如下图15，统一配置1×107个/ml的孢子悬浮液1ml，往pda平板上加入200ul，用涂布棒涂抹均匀，每瓶培养基做3次重复。在26℃恒温箱培养12天后，将平板放置于显微镜底下观察，每个平板取5个视野，孢子萌发率取五个视野孢子萌发率平均值，每瓶培养基真菌esteyavermicola孢子萌发率取三次重复试验孢子萌发率平均值，结果如图16所示，大米培养基培养的真菌esteyavermicola孢子在26℃恒温箱培养了24h后，三瓶培养基孢子萌发率平均值达到89.84％。

实施例3

本实施实例提供真菌esteyavermicolapdb液体培养过程及菌萌发情况，其制备方法如下：

pda培养基(g养基(过)：自然ph值，水1l，葡萄糖20g，马铃薯200g，琼脂18g。

将配置好的pda培养基在121℃下灭菌20min，灭菌后，在无菌条件下，在真菌中菌落生长旺盛的平板边缘，取5mm大小的菌块，接种到pda培养基中间，用封口膜封好。首先于26℃恒温培养箱中培养2周；

真菌悬浮液制备：将配置好的1lpdb液体培养基倒入4个500ml锥形瓶中，每个锥形瓶倒入250ml，121℃高压蒸汽灭菌20min。其次将pda培养活化过的真菌转接到pdb培养基中，接着于26℃恒温摇床上振荡培养。

7天后用抽滤装置过滤得到纯的孢子悬浮液，往pda平板上加入200ul，用涂布棒涂抹均匀，每瓶培养基做3次重复。在26℃恒温箱培养一周后，将平板放置于显微镜底下观察，每个平板取5个视野，孢子萌发率取五个视野孢子萌发率平均值，每瓶培养基真菌esteyavermicola孢子萌发率取三次重复试验孢子萌发率平均值。

试验结果如图18和图19所示，用pdb液体培养基培养的真菌esteyavermicola在26℃条件下培养7天后，测定其孢子萌发率是100％，而培养至第14天，再次测定每瓶培养基的孢子萌发率最高只有3.77％，这与相同温度下用大米培养基培养的真菌esteyavermicola萌发率相比，后者在培养至第19天真菌萌发率最低也是40％左右，最高能达到80％以上(图12、图17)。本实施例表明，pdb液体培养基和大米培养基虽然都可以大量生产松材线虫病内寄生菌esteyavermicola孢子悬浮液，但是在常温下，大米培养该菌的保存时间更长，并且对于使用该菌进行野外防治松材线虫病，固体培养比液体培养在运输过程中更为便利。