通过ChIP研究表观遗传学

​了解需要 ChIP 分析的不同表观遗传因子，并帮助您确定适合您的 ChIP 方法

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染色质免疫沉淀 (Chromatin immunoprecipitation，ChIP) 是一项强大的技术，研究人员可以在自然条件下检测表观遗传调控因子与 DNA 之间的相互作用。利用 ChIP，研究人员可在整个基因组内识别目的蛋白结合的特定基因和序列，为其调控功能和机制提供关键线索。通过解析蛋白质-DNA 相互作用的时间和空间动态，ChIP 提供了对核心生物学过程和疾病病理学的见解。

ChIP 用途极广，可在多种应用中使用。从查看序列特异性蛋白结合到整体调控过程，ChIP 为研究人员提供了整合发现和绘制复杂表观遗传调控系统全貌的工具。

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ChIP 在阐明基因调控、转录机器和染色质结构方面发挥了核心作用。下面是利用 ChIP 可以检测的一些关键蛋白。

转录因子

通过检测特定转录因子在基因组中的结合位置和时间，研究人员已经确定了特异性结合位点和序列，精确定位了下游基因激活，并揭示了转录因子的全基因组调控程序。

通过 ChIP 和其他方法进行的进一步研究，揭示了这些转录因子是疾病病理学背后的主要调控者，参与编排了导致癌症、自身免疫性疾病、过敏和许多其他疾病的表观遗传失调。通过识别这些主调控因子及其下游的遗传程序，ChIP 为多种疾病的诊断和治疗策略提供了新的靶标。

转录机制

ChIP 研究检测了 RNA 聚合酶 II 以及其他转录组分的结合位点，揭示了启动子和增强子序列以及转录调控的新机制。

染色质结构

ChIP 研究在组蛋白密码的发现和表征方面起着关键作用。通过绘制特定组蛋白修饰的结合位置，并与已知的基因激活状态进行比较，研究人员已经记录了特定组蛋白残基上的乙酰化或甲基化如何影响基因激活或沉默以及高阶染色质结构。通过 ChIP，这些组蛋白修饰特征可以用来预测表观遗传调控在特定基因组区域的那些特性。

随着新组蛋白修饰和染色质调控元件的发现，在基因组调控中，ChIP 仍然是揭示这些元件的功能及其相互作用复杂性的重要工具。

组合分析

​​将多种蛋白质的 ChIP 分析结合起来，是构建基因组调控全貌的有效方法。通过该方法，研究人员能够研究不同类型的蛋白及蛋白复合物如何在空间和时间上在特定基因或基因组上的特定位点进行相互作用，从而调控基因转录 (Barski et al., 2007)。

ChIP 拓展了表观遗传学研究的范围和精度

​​ChIP 有助于在多种尺度上分析表观遗传机制，精确性极佳。下面是可以利用 ChIP 实现的内容。

局部表观遗传机制

全基因组表观遗传程序设计

动态表观遗传过程

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ChIP方案是利用抗体免疫沉淀目的蛋白及其结合的 DNA，然后回收纯化 DNA，并通过 PCR、微阵列或测序进行分析，以确定基因组序列和蛋白结合位置。

ChIP流程可分为 5 个基本部分（图 1）：

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图 1：ChIP 方案工作流程。

​1.交联

在某些情况下，可能需要将DNA 和蛋白质交联来稳定其相互作用，特别是以蛋白复合物身份参与相互作用但并不直接接触 DNA 的蛋白质。交联可以在特定的时间点固定冻结这些分子间的相互作用，这种ChIP称为交联 ChIP (X-ChIP)。相反，自然 ChIP (N-ChIP) 无需预先交联。

交联一般用甲醛进行，甲醛可使蛋白质与 DNA、RNA 和其他蛋白质发生可逆性交联。其他化学物质，如顺铂，只能用于 DNA 和蛋白质之间的选择性交联。研究 DNA 和特别大的蛋白质/RNA 复合物之间的相互作用时，可能需要用额外的试剂进行双重交联。UV 交联是不可逆的，因此与 ChIP 不兼容。

2.    染色质片段化

染色质必须片段化，才能进行有效的免疫沉淀，并将靶抗原精确地定位到基因组上。DNA 片段的大小将最终决定基因组图谱的分辨率，因此优化片段化方案很重要。

步骤 1 和步骤 2的优化对于获得最高质量的 DNA 并用于后续的 ChIP 分析是非常重要的。

3.    免疫沉淀

目的蛋白及其结合的 DNA 片段被免疫沉淀。利用琼脂糖微珠或磁珠将染色质混合物与目的蛋白及抗体在 4°C 条件下一起孵育过夜，形成微珠/抗体/蛋白/DNA 复合物。然后通过离心收集Protein A、Protein G 或Protein A/G 琼脂糖微珠，或通过磁管架收集磁珠，从而免疫沉淀抗体/蛋白/DNA 复合物。非特异性结合在后续洗涤过程中去除。

4.    DNA 回收和纯化

通过 SDS 和加热，从微珠上洗脱抗体/蛋白质/DNA 复合物。X-ChIP 接着必须通过氯化钠和加热逆转蛋白质和 DNA 的交联。然后用蛋白酶 K 和 RNase A 降解存在的任何蛋白质和 RNA，剩余的 DNA 用酚氯仿抽提或 PCR 纯化试剂盒纯化。

您可以登录www.abcam.com/X-ChIP查看我们的完整 X-ChIP 实验方案

也可以登录www.abcam.com/N-ChIP查看我们的 N-ChIP 实验方案

5.    分析 DNA

接下来通过 qPCR、杂交阵列 (ChIP-on-Chip) 或新一代测序 (ChIP-seq) 分析纯化的 DNA，以识别并定量已被免疫沉淀的序列。这些序列被定位到基因组，以确定目的蛋白结合的基因和区域。 

交联的目的在于将靶抗原固定在其染色质结合位点上。组蛋白本身一般不需要交联，因为它们已经与 DNA 紧密相连。其他亲和力较弱的 DNA 结合蛋白或组蛋白可能需要交联才能将固定到位。

​​染色质片段化差异

​N-ChIP 和 X-ChIP 都需要通过染色质片段化来使相互作用的蛋白/DNA 复合物容易被抗体接近，可以 通过利用微球菌核酸酶或超声处理来片段化 (Neill et al., 2003)。 

N-ChIP：对于 N-ChIP 实验，用微球菌核酸酶进行酶消化应该足以将您的样本分解成单个核小体片段（含有大 约 175 个碱基对 DNA 的单体）。 

•        纯化的核小体单体不适合分析转录因子及某些染色质结合子的相互作用，这些转录因子通常与核 小体间 DNA 结合。建议在这些情况下进行超声处理。 

•        核小体是动态的，可能在酶消化过程中重排。这会给基因组特定区域的绘制带来一定的问题，并且 任何变化都应该用合适的对照来监测（见定量 PCR 的检测对照）。在没有交联的情况下，应将 XChIP 用作对照，以评估任何动态变化和不需要的变化。 

•          酶切不会产生完全随机的染色质片段。微球菌核酸酶对基因组序列的某些区域有倾向性，造成对 DNA 的消化不均匀或不相同。某些位点可能被过度表达，而其他位点可能不存在，这将影响数据 的准确性。

•          ​为了确保消化的一致性，购买原液酶后务必进行分装，并在每次进行实验时，使用新的分装原液酶 进行时间梯度消化。虽然存储过程中，酶的质量可能会随着时间的推移发生变化，但染色质制备中 的变化风险（压缩程度等）会更高；新的染色质样本制备过程不能简单和之前处理的其他样本相同。 

X-ChIP：甲醛交联限制了微球菌核酸酶等酶接近其靶点，使得酶消化在 X-ChIP 实验中不起作用。取而代之的 是通过超声处理产生 500-700 碱基对（2-3 个核小体）的随机 DNA 片段。 

•         避免起泡，起泡会减少溶液内的能量转移，降低超声效率。超声处理也可能受到交联时间、细胞密 度或细胞类型的影响。 ​

•          超声处理的染色质可以在液氮中快速冷冻并在 -80℃下保存长达 2 个月，但要避免反复冻融。 ​

•          尽管超声处理理论上不会有切割倾向性，但实际上很少如此。 ​

•         DNA 片段通常较大，会影响检测的分辨率。但是，长达 1.5 kb 大小片段的分辨率能实现 ChIP 的 多数目的。微球菌核酸酶消化结合超声处理可提高分辨率，对温和或不完全交联的样本可能有用。 ​

无论选择哪种片段化方法，重要的是，在设置实验时，应始终优化片段化时间，以优化片段大小。 

表 4：N-ChIP 相对 X-ChIP 的优缺点。 

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N-ChIP

X-ChIP

优势

高效沉淀 DNA 和组蛋白

适用于非组蛋白。可对所有细胞类型、组织和生物体进行检测。

结合特异性的可预测性更高

实现 DNA-蛋白质、RNA-蛋白质和蛋 白质-蛋白质交联

高分辨率（约 175 bp/单核小体）

减少染色质重排的机会

缺点

仅适用于组蛋白

过度固定会妨碍有效的超声处理

Input 染色质不同可能产生不同选择性核酸酶消化

甲醛可能改变抗原的结合特性

高浓度的核酸酶可能过度消化染色质

与 N- ChIP 相比，分辨率较低

并不是所有的抗体都适合 ChIP 实验，而且很多抗体不符合 ChIP 质量要求或未经过 ChIP 应用验证。 选择合适的 ChIP 级抗体对您成功地进行 ChIP 实验而言至关重要。

如果没有市售抗体，或者您想尝试一种尚未经 ChIP 测试的抗体： 

ChIP 方案和数据分析可能较为复杂，因此添加正确的对照来确保实验正常进行非常重要。 

样本对照 

​​设置未进行免疫沉淀的 Input 样本对照，以便与免疫沉淀样本结果进行比较，这一点至关重要。这种比 较最终会使数据标准化，以提供可解释的结果。

对组蛋白修饰进行免疫共沉淀时，纯化的组蛋白 H3 和 H1 可以作为组蛋白制备质量的阳性对照（组 蛋白 H1 常用于 X-ChIP）。 

抗体对照 

​不同的抗体对照对于确保免疫沉淀成功以及排除污染可能性而言非常重要。下面是关键对照的部分示例： 

染色质重塑也可能会移动或移除特定位点的组蛋白（例如活性启动子位点）。为了确认核小体保留在特 定基因组位点，应使用针对非修饰组蛋白（如组蛋白 H3）的对照抗体。分析组蛋白修饰时，用抗 组 蛋白 H3 抗体为组蛋白研究标准化。 

定量 PCR 对照 

如果通过 qPCR 分析数据，则需要额外的对照，以确保数据分析的质量。基因组的某些区域会比其他 区域纯化效果更好，并且一些核小体在酶促断裂过程中可能发生重排。因此，针对 Input 以及 ChIP 纯 化后 DNA 的多个个区域设计 PCR 引物，避免虚假结果。裂解起始细胞，制备 Input，并取样用于 ChIP 实验的平行对照。

此外，在 qPCR 阶段，对您知道应该或不应该结合目的蛋白的基因组位点进行阳性和阴性对照 qPCR 至关重要。此外，还有必要进行不加模板对照 qPCR，作为阴性对照，以确保 PCR 过程中没有污染。

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ChIP 方案必须对多个步骤进行优化才能达到最佳效果。以下是您需要进行额外优化的内容，优化后才 能获得最佳 ChIP 结果。 

交联（仅 X-ChIP）。

甲醛推荐用于可逆交联。甲醛是一种高效的 DNA-蛋白质交联剂，但不是一种有效的蛋白质-蛋白质交 联剂，因此很难对不与 DNA 直接结合的蛋白质进行 ChIP 分析。其他交联剂可用于不同距离分子间 的交联。

交联过程对时间要求严格，通常是几分钟。过度交联会产生多个问题，包括抗原可及性和超声效率降 低。举个例子，抗原决定簇可能被掩盖或改变，导致抗体与抗原的结合减少。 

染色质片段化 

将染色质切割成适当大小至关重要。片段大小应小于 1kb，但最好为 200-1000 bp。通过 MNase 酶切 将片段切割成单核小体水平（175 bp），可以实现最佳分辨率。设置酶切消化时间梯度摸索最佳消化时 间（2-30 min），纯化 DNA 凝胶电泳，以确定达到最佳 DNA 片段大小的条件和时间（图 7）。 N-ChIP 和 X-ChIP 都需要优化片段化时间。 ​​

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​​图 2​：超声时间梯度实验示例。对 U2OS 细胞进行 5、10、15 和 20 分钟的超声处理。逆转交联并在 1.5% 琼脂糖 凝胶上电泳纯化的 DNA。片段大小随着超声时间增加而不断减小。15 分钟时观察到最佳片段大小。 

抗体浓度 

抗体的效价对优化信噪比有重要意义。以每 25-35 mg 纯化核小体单体加 3-5 µg 抗体为起始量。对于 定量 ChIP，您可能需要染色质和抗体等量匹配。ChIP 通常需要大量的一抗（每 ug 微珠需要 1-10 μg 一抗）。与许多实验技术一样，必须在实验开始时优化抗体的用量。 

洗涤缓冲液 

​确定洗涤步骤中缓冲液组分的合理浓度，通常是 250-500 mM 氯化钠或氯化锂。盐和洗涤剂的浓度越 高，洗涤结果越好。但是，必须在低背景和对靶标的破坏之间取得平衡。如果缓冲液过强，会破坏特异 性抗体相互作用，导致信号偏低。如果缓冲液不够强，非特异性的相互作用将仍然存在，导致高背景。 NP-40 可作为去污剂，而 X-ChIP 常用 RIPA 缓冲液。 

标准 ChIP 工作流程需要大量的细胞。需将约 106 至 107 个细胞作为起始材料，如果低于该细胞量， 检测会受到高背景结合、低富集效率和富集文库复杂性丧失影响。但是，获得这么大的样本量很难，特 别是在检查像转基因小鼠组织或临床样本这种珍贵的样本类型时。可以应用一些策略解决样本含量少 的问题。 

1. 提高富集效率，最大限度地减少样本损失 

​对 ChIP 工作流程作出一些调整可以提高富集效率，并最大限度地减少低 Input 样本的样本损失 (Mao et al., 2013 and Dirks et al., 2016)。 

Abcam 的高灵敏度 ChIP 检测试剂盒采用独特的嵌合蛋白来捕获抗体/蛋白/ DNA 复合物，具有以下显著优势： 

2.读数和下游数据处理平台 

​除了检测本身，下游处理（即测序、阵列或 PCR）和生物信息学分析的选择与优化同样重要。 

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​​组织 ChIP

​检查特定组织中的表观遗传机制可以揭示组织特异性遗传编程、发育和生物过程的基本要素。ChIP 可 作为检测组织特异性转录因子、基因活化和表观遗传调控的其他方面作用和机制的有效工具。对组织 样本进行 ChIP 需要专门的染色质制备方案，以确保 Input 材料的质量和可靠的结果。

所需的组织用量取决于蛋白质丰度、抗体亲和力和交联效率。每次进行 ChIP 测定时，使用 5-15 μg 染 色质优化以下方案，每次 ChIP 大概准备 30 mg 肝组织。开始 X-ChIP 检测之前，应确定每种组织类 型的确切染色质浓度。 

点击此处查看我们来自组织样本的 ChIP 方案。 

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即使进行了优化，首次实验的结果也可能不尽完美。您可以在这里找到一些常见问题及其相应的解决方案。 

​不加抗体对照中出现高背景 

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潜在问题

解决方案

与微珠非特异性结合

增加额外洗涤或者免疫沉淀之前将超声处理的染色质与 Protein A/G 微珠一起孵育 1 小时进行预清除步骤

微珠背景高

尝试不同品牌的微珠和不同的封闭策略，了解哪种微珠和策略在您的对照中提供的背景最低

洗涤缓冲液受污染

更换缓冲液

​低信号 

潜在问题

解决方案

细胞未有效裂解

RIPA 缓冲液应该有良好效果

起始材料不足

ChIP 通常需要大量的 Input，每种 IP 条件下至少有 25 μg 染色质（3-4 百万个细胞）

染色质片段可能太小

琼脂糖凝胶电泳，确保大小正确，必要时再次优化片段化

抗体不足

通常 3-5 μg 即可，但如果未观察到信号，则可能需要高达 10 μg

单克隆抗体可能不适合，特别是对 X-ChIP 而言，因为交联可能会掩盖表位

尝试多克隆抗体或 ChIP 级单克隆抗体

洗涤缓冲液过强，消除了特异性抗体结合

缓冲液中的氯化钠不得超过 500 mM。如上所述，应对洗涤缓冲液进行优化

亲和微珠选择错误

确保抗体种类和亚型与选择的微珠结合或使用 ProteinA/G 混合微珠

如果使用的是 X-Chip，细胞可能交联时间过长，降低了表位的可及性；或者过短，减少了 IP 过程中 DNA 的下拉

分析 DNA 亲和力较弱的蛋白质可能需要 X-ChIP，以保持蛋白质与 DNA 的交联

此外，还需优化交联的时间

​​注：信号低可能是真的，而且目标区域没有抗体富集。

添加阳性对照抗体和位点，确认 ChIP 有效。

抗原可能存在，但不结合在预期的基因组位点。 

​整个较大区域内，分辨率低且背景高 

潜在问题

解决方案

DNA 片段可能过大

片段大小应小于 1kb，但最好为 200-1000 bp。 通过 MNase 酶切将片段切割成单核小体水平 （175 bp），可以实现最佳分辨率。琼脂糖凝胶电泳确认，必要时进一步优化染色质片段化步骤。

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​PCR 扩增问题 

PCR 后，所有样本出现高信号，包括不加模板对照 

潜在问题

解决方案

qPCR 溶液可能被污染

采用储备原液制备新溶液

​​样本中无 DNA 扩增 

潜在问题

解决方案

qPCR 溶液可能被污染

采用储备原液制备新溶液

​​还有哪些处理可能会影响我的 ChIP 结果？

一些抗体会受到浓度相对较低的 SDS 的影响。添加 TSA、丁酸盐或秋水仙胺一般不会影响 ChIP。

请勿在高转速（不超过 6,000 rpm）下离心琼脂糖凝胶微珠，高转速会压缩并损坏微珠。 

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​ChIP 结果分析

​一旦拉下的 DNA 片段被免疫沉淀和纯化，可以通过不同的方法对其进行分析。 

​​qPCR 

​利用基因或靶标特异性引物扩增纯化 DNA 中已知的靶标位点 

局限性： 

ChIP-on-Chip 

​​采用微阵列检查整个基因组内多个目标位点、特定结构域等的存在。扩增下拉样本和对照样本 DNA， 并用互补荧光探针标记。合并样本并与目标微阵列杂交。荧光信号的比率表示目的蛋白已经结合的富集区域。 

局限性： 

ChIP-seq 

​最常用的全基因组分析方法是提高碱基对分辨率，没有 ChIP-on-Chip 所遇到的限制。扩增下拉 DNA 和对照样本 DNA，然后对片段进行高通量测序，再将其与基因组进行比对。重叠片段形成一个峰，代 表目的蛋白与基因组结合的位置。 

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图 3：ChIP seq 概述。进行 ChIP 后，将沉淀的 DNA 用于文库制备、测序，然后将获得的序列定位到参考基因组上， 接着再进行峰检测，以确定目的蛋白的结合位点。 

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​数据分析

应针对起始材料的量不断进行数据标准化，以消除样本量不均匀引起的误差。若要标准化数据，取最 终扩增子值，并将其除以 Input 的扩增子值。对于组蛋白修饰，除了 Input 量可以来标准化，相应组蛋 白免疫沉淀量也可以作为标准化参照。例如，通过 H3K4me3 抗体进行的 ChIP 可以用 Input 量和组蛋 白 H3 免疫沉淀量标准化。

测量起始材料的数量（和质量）是有效解释结果的关键。 

使用在线软件进行 ChIP-seq 数据分析的教程 

虽然 ChIP-seq 数据分析可能很复杂，但它可能是实验中最重要的部分。稳健的数据分析是获得准确、 可靠结果的关键。在线工具为生物信息学专家和实验室生物学家提供了分析数据的机会。 本分步指南说明了如何从 ChIP-seq 数据中提取可靠的结果，以及如何解读数据集，从而成功进行 ChIP-seq 分 析 (Hurtado et al., 2010 and Yan et al., 2013) 。 如 欲 了 解 更 多 信 息 ，在此处查看 Abcam 的数据分析网络研讨会。

​​本次网络研讨会涵盖了 ChIP 数据分析的以下步骤： 

1. 测序读段 QC (FastQC)

2. 读段比对/匹配 (Galaxy/bowtie)

3. 峰检测 (Galaxy/macs)

4. 结合信号可视化（UCSC genome browser）

5. De novo 基序查找（MEME-ChIP）

6. 结合位点的基因本体分析 (GREAT)

7. 结合信号的热图生成 (seqMINER) 

参考文献 

Barski A, Cuddapah S, Cui K, Roh TY, Schones DE, Wang Z, Wei G, Chepelev I, Zhao K. High-resolution profiling of histone methylations in the human genome. Cell.18;129(4):823-37(2007) 

Bolduc, N. Preparation of low-input and ligation-free librarIes using template-switching technology. In Current protocols in molecular biology (Vol. Unit 7.26).Wiley & Sons.(2016). 

Cejas, P. Chromatin Immunoprecipitation from fixed clinical tissues reveals tumor-specific enhancer profiles. Nature Medicine.22, 685.(2016). 

Dirks, R. Genome-wide epigenomic profiling for biomarker discovery. Clinical Epigenetics.8, 122.(2016) 。 ENCODE.(n.d.).ENCODE Platform Comparison. Retrieved from https://genome.ucsc.edu/ENCODE/platform_ characterization.html 

Gilfillian, G. Limitations and possibilities of low cell number CHIP-SEQ. BMC Genomcis.13, 645. (2012). 

Hurtado A, Holmes KA, Ross-Innes CS, Schmidt D, Carroll JS. FOXA1 is a key determinant of estrogen receptor function and endocrine response.Nat Genet.2010;43(1):27-33. 

Kidder, B. ChIP-Seq: Technical considerations for obtaining high quality data. Nature Immunology.12, 918.(2011). 

Mao. Accounting for immunoprecipitation inefficiences in the statistical analysis of ChIP-Seq data. BMC Bionformatics.14, 169 (2013). 

Neill O. P. L, Turner M. B. Immunoprecipitation of native chromatin: NChIP. Methods. Sep; 31(1):76-82 (2003) 

Reverberi, R. Factors affecting the antigen-antibody reaction. Blood transfusion.5, 227.(2007). 

Schmidl, C. ChIPmentation: fast, robust, low-input ChIP-Seq for histones and transcription factors. Nature Methods.12, 963.(2015)。 

Stelloo, S. Androgen receptor profiling predicts prostate cancer outcome. EMBO Mol Med. 7, 1450. (2015)。Xiong, X.A scalable epitope tagging approach for high throughput ChIP-Seqanalysis. ACS Synth biol.(2017, Feb 19). 

Yan J, Enge M, Whitington T, Dave K, Liu J, Sur I, Schmierer B, Jolma A, Kivioja T, Taipale M, Taipale J. Transcription factor binding in human cells occurs in dense clusters formed around cohesion anchor sites. Cell. 2013; 154(4):801-13. 

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