构建LPS诱导的急性炎症小鼠模型用于IDO1抑制剂药效动力学评价

吲哚胺2，3双加氧酶1（indoleamine 2，3-dioxygenase 1，IDO1）是沿犬尿氨酸通路（kynurenine pathway，KP）分解代谢人体必需氨基酸色氨酸（tryptophan，Trp）生成犬尿氨酸（kynurenine，Kyn）等中间代谢物及终产物辅酶NAD（nicotinamide adenine dinucleotide）的首个限速酶[1]。IDO1在哺乳动物的中枢神经系统、附睾、肠、胸腺、呼吸道、脾脏等组织中均有表达[2]。KP异常与神经退行性疾病、抑郁、心血管疾病和恶性肿瘤等疾病的病理机制密切相关，在上述疾病患者中IDO1高表达或过度活化伴KP上调多见[3-6]。阿尔兹海默症（Alzheimer’s disease，AD）患者以及抑郁症患者血清中IDO1活性高于健康个体[7-8]；IDO1活性与动脉粥样硬化的早期标志物颈动脉内膜/中层厚度（intima media thickness，IMT）呈显著正相关[9]。IDO1高表达还与多种肿瘤的不良预后正相关[10]。近年，IDO1在肿瘤免疫逃逸中的作用也受到关注。在肿瘤微环境中，高表达的IDO1消耗Trp，蓄积Kyn，诱导效应T细胞凋亡及功能障碍[11]，活化调节性T细胞（regulatory T cells，Tregs）[12]，营造免疫抑制的微环境，进而造成肿瘤免疫逃逸。因此，IDO1是AD、抑郁、动脉粥样硬化、肿瘤等疾病治疗的重要靶标。

开发IDO1抑制剂靶向IDO1阻断KP是疾病治疗的重要策略。研究发现抑制IDO1可改善AD小鼠认知行为，具有一定的治疗作用[13]。IDO1抑制剂1-甲基色氨酸（1-methyl-tryptophau，1-MT）可下调抑郁小鼠血清中IDO1活性，减轻抑郁行为[14]。IDO1抑制剂在多种肿瘤小鼠模型中展现出良好的抗肿瘤作用。对黑色素瘤B16荷瘤小鼠连续14天腹腔注射75 mg/kg IDO1抑制剂5I，肿瘤抑制率达到75%[15]；灌胃给予30或100 mg/kg IDO1抑制剂INCB024360均能显著抑制大肠癌CT26荷瘤小鼠的肿瘤生长[16]。多个IDO1抑制剂单用或联合其他药物用于癌症治疗的研究也已进入临床试验阶段，如Indoximod、PF-06840003、Epacadostat、Nnavoximod、KHK2455和BMS-986205等。

IDO1抑制剂的研发必须开展药效动力学评价，即研究IDO1抑制剂对KP的阻断作用。有研究以Kyn水平的降低作为IDO1活性被抑制的衡量标准[15]，更多研究以Kyn与Trp的比值（即Kyn/Trp）减小作为标准，后者能更准确地反映IDO1活性的改变。现有的用于IDO1抑制剂药效动力学评价的动物模型有naïve鼠[15]和荷瘤小鼠[17]。使用naïve鼠进行IDO1抑制剂药效动力学评价一般采用单次给药，故实验耗时短。但是naïve鼠处于正常生理状态，本底IDO1水平较低，使用抑制剂后引起Kyn浓度或（Kyn/Trp）×100的改变非常有限，不能准确反映IDO1抑制剂对IDO1活性的抑制效力。荷瘤小鼠的IDO1活性高于naïve鼠的IDO1活性，但用于IDO1抑制剂药效动力学评价实验周期较长。乳腺癌4T1荷瘤小鼠和肺癌LLC荷瘤小鼠用于实验需耗时21天和18天[18-19]。因此，有必要对现有的IDO1抑制剂药效动力学评价的动物模型进行改进，建立短时间内显著上调体内IDO1活性的动物模型，以提高实验效率和结果准确性。

脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）可诱导炎症反应，通过激活TLR4/NF-kB信号通路上调小鼠体内IDO1活性[20-21]。LPS的给药方式主要有腹腔注射[22]、尾静脉注射[23]、鼻饲[24]等。本文选用昆明鼠及C57BL/6小鼠，通过尾静脉注射及腹腔注射两种不同的给药方式给予小鼠LPS。造模以后，对模型小鼠灌胃给予IDO1抑制剂TQ016，给药后不同时间点取血，HPLC检测小鼠血清中Kyn和Trp含量，用（Kyn/Trp）×100反映IDO1活性。研究LPS诱导的炎症小鼠模型用于IDO1抑制剂药效动力学评价的可行性，评价IDO1抑制剂TQ016的药效动力学。

动物  选取昆明鼠45只和C57BL/6鼠225只（5周龄，雌性，上海杰思捷实验动物有限公司），饲养过程及实验过程符合标准。

试剂和药品  羧甲基纤维素钠（CMC-Na）（上海昌为医药辅料有限公司），L-1-MT、LPS（美国Sigma-aldrich公司），L-Trp、L-Kyn、色谱级甲醇、色谱级乙腈（阿拉丁试剂上海有限公司），TQ016、乙酸钠（上海文旻生化科技有限公司），冰醋酸（国药集团化学试剂有限公司），高氯酸（鑫源化工有限公司），小鼠饲料及垫料（上海斯莱克实验动物有限公司）。

仪器和设备  涡旋仪（美国Thermo Scientific公司），电子天平（赛多利斯科学仪器有限公司），超声波细胞粉碎仪（宁波海曙科生超声设备有限公司），立式压力蒸汽灭菌锅（上海博讯实业有限公司），SW-CJ-1FD洁净工作台（苏州净安泰空气技术有限公司），Legend Micro 17R高速离心机（美国Thermo Scientific），高效液相色谱仪、C18柱（美国Agilent公司）。

溶液及药物配制

LPS溶液  配制0.9% NaCl溶液（生理盐水），用0.22 μm水相滤头过滤。将5 mg/mL LPS母液用生理盐水稀释后用于尾静脉注射和腹腔注射。

0.5% CMC-Na溶液  100 mL生理盐水经0.22 μm水相滤头过滤，50 ℃水浴加热，称取0.5 g CMC-Na加入其中，完全溶解后于4 ℃保存。

L-1-MT溶液  称取34.2 mg L-1-MT置于4 mL EP管中，加入2 mL 0.5% CMC-Na溶液，于超声波细胞粉碎机中超声10 s，冰浴冷却，循环操作，直至L-1-MT完全溶解，补加0.5% CMC-Na溶液至3.8 mL，封口膜封口，于超声波清洗器中超声10 min，4 ℃保存。按小鼠体重18 g给药0.2 mL计算，剂量为100 mg/kg。

TQ016溶液  配制方法同L-1-MT。按小鼠体重20 g给药0.2 mL计算，剂量分别为25、50和100 mg/kg。

炎症小鼠模型构建  昆明鼠尾静脉注射0.66 mg/kg LPS，24 h后用于给药实验。C57BL/6小鼠腹腔注射5或8 mg/kg LPS，24 h后用于给药实验。

小鼠给药  昆明鼠随机分为4组：1个对照组和3个LPS造模组（给药剂量约为0.66 mg/kg）。对照组（5只）和LPS组（16只）灌胃给予0.5% CMC-Na，LPS+L-1-MT组（6只）和LPS+TQ016组（18只）分别灌胃给予100 mg/kg L-1-MT和100 mg/kg TQ016。各组小鼠于给药后40 min、2 h和4 h摘眼球取血。

C57BL/6小鼠随机分为5组：1个对照组和4个LPS造模组（给药剂量为5或8 mg/kg）。对照组（6只）、5 mg/kg LPS组（8只）和8 mg/kg LPS组（8只）灌胃给予0.5% CMC-Na，5 mg/kg LPS+L-1-MT组（8只）和8 mg/kg LPS+L-1-MT组（8只）灌胃给予100 mg/kg L-1-MT。各组小鼠于给药后4和12 h摘眼球取血。

C57BL/6小鼠随机分为3组：1个对照组和2个LPS造模组（给药剂量为5 mg/kg）。对照组（20只）和LPS组（21只）灌胃给予0.5% CMC-Na，LPS+TQ016组（27只）灌胃给予100 mg/kg TQ016。各组小鼠于给药后1、6、12、24和30 h摘眼球取血。

C57BL/6小鼠随机分为5组：1个对照组和4个LPS造模组（给药剂量为5 mg/kg）。对照组（20只）和LPS组（21只）灌胃给予0.5% CMC-Na，LPS+25 mg/kg TQ016组（26只）、LPS+50 mg/kg TQ016组（26只）和LPS+100 mg/kg TQ016组（26只）分别灌胃给予25、50和100 mg/kg TQ016。各组小鼠于给药后1、6、12、24和30 h摘眼球取血。

小鼠血清制备  小鼠全血室温静置1 h，4 ℃下900×g离心10 min，吸取上清，得粗血清。将粗血清按上述条件再次离心10 min，吸取上清，得纯血清。加入等体积5%高氯酸溶液，涡旋混匀30 s，室温静置15 min，室温下16 200×g离心10 min。取上清，加入1/2体积的色谱级甲醇，涡旋混匀2 min，室温下16 200×g离心10 min。取上清，用0.22 μm水系滤膜过滤，向标记好的内衬管中加入200 μL处理好的血清，4 ℃保存，待HPLC检测。

HPLC检测条件  C18柱（250 nm×4.6 mm，5 μm），柱温25 ℃，流动相为15 mmol/L乙酸-乙酸钠溶液（pH=3.6）∶乙腈=94∶6，流速1 mL/min，进样量20 μL。检测波长：Trp为280 nm，Kyn为360 nm。

统计学分析  数据统计采用GraphPad Prism6.0软件，所有数据均以x±s表示，多组间比较采用单因素方差分析，两组间比较采用独立样本t检验，P < 0.05为差异有统计学意义。

尾静脉注射LPS小鼠的IDO1活性上调  昆明鼠尾静脉注射0.66 mg/kg LPS造模24 h后用于给药实验（图 1）。模型小鼠血清中Trp含量下调（2 h：P=0.012 9，4 h：P=0.022 7），Kyn含量[40 min：P=0.038 6，2 h：F（4，4）=4.871，P=0.026 3]及IDO1活性上调[40 min：P=0.032 8，2 h：P=0.002 1，4 h：F（2，11）=3.94 1，P=0.042 3]。尾静脉注射0.66 mg/kg LPS可上调小鼠血清中IDO1活性，造模成功。

IDO1抑制剂对尾静脉注射LPS小鼠IDO1活性的抑制作用  模型小鼠灌胃给予IDO1抑制剂L-1-MT 2 h后，被LPS下调的Trp含量略恢复（图 1A），被LPS上调的Kyn含量[F（4，5）=4.399，P=0.030 0]（图 1B）和IDO1活性[F（4，5）=6.377，P=0.006 8]，（图 1C）显著降低。说明L-1-MT在灌胃给药2 h后具有明显的IDO1活性抑制作用。

模型小鼠灌胃给予IDO1抑制剂TQ016 40 min后，被LPS下调的Trp含量略恢复；2、4 h后，被LPS下调的Trp含量显著上调[2 h：P=0.027 9，4 h：F（3，4）=1.389，P=0.005 2]（图 1D）。TQ016对Kyn含量无明显影响（图 1E）。模型小鼠灌胃给予TQ016 40 min、2 h和4 h后，被LPS上调的IDO1活性降低且在TQ016灌胃2 h后差异有统计学意义[F（4，5）=2.585，P=0.035 3]（图 1F）。尾静脉注射0.66 mg/kg LPS可构建IDO1活性上调的模型小鼠，IDO1抑制剂L-1-MT和TQ016灌胃给药2 h后可显著抑制模型小鼠体内被LPS上调的IDO1活性。

腹腔注射LPS小鼠的IDO1活性上调  与对照组相比，腹腔注射5、8 mg/kg LPS均能下调C57BL16小鼠血清中Trp含量（图 2A、2D），上调Kyn含量（图 2B、2E）和显著上调IDO1活性[5 mg/kg LPS组（图 2C）：4 h，F（3，2）=8.627，P=0.011 9；12 h，F（2，2）=1.214，P=0.020 8；8 mg/kg LPS组（图 2F）：4 h，F（2，2）=37.900，P=0.000 4；12 h，F（3，2）=11.010，P=0.010 8]。

L-1-MT对腹腔注射LPS小鼠IDO1活性的抑制作用  5 mg/kg LPS造模组灌胃给予L-1-MT 4 h后，被LPS下调的Trp含量可恢复（图 2A），被LPS上调的Kyn含量[F（3，3）=1.739，P=0.016 9]（图 2B）和IDO1活性[F（3，3）=5.417，P=0.010 9]（图 2C）显著降低。灌胃给予L-1-MT 12 h后，血清中Trp、Kyn含量和IDO1活性均无明显变化（图 2A~2C），可能与L-1-MT的半衰期和药代动力学性质有关。

8 mg/kg LPS造模组灌胃给予L-1-MT 4 h后，血清中Trp含量无明显变化（图 2D），被LPS上调的Kyn含量显著降低[F（2，2）=3.647，P=0.026 6]（图 2E），被LPS上调的IDO1活性降低（图 2F）。灌胃给予L-1-MT 12 h后，血清中Trp和Kyn含量以及IDO1活性均无明显变化（图 2D~2F）。综合以上实验结果，我们选用5 mg/kg LPS腹腔注射用于评价TQ016的药效动力学。

TQ016对腹腔注射LPS小鼠IDO1活性的抑制作用  5 mg/kg LPS造模组小鼠在腹腔注射LPS 24 h后体重下降（1.57±0.57）g，对照组小鼠在腹腔注射生理盐水24 h后体重增加了（0.64±0.57）g。

与对照组小鼠相比，在给药后不同时间点，LPS造模组小鼠血清中Trp含量均下降（图 3A），Kyn含量均显著增长（1 h：P=0.042 8，6 h：P=0.019 4，12 h：P=0.019 4，24 h：P=0.005 3，30 h：P=0.003 5）（图 3B），IDO1活性在给药后1、6、12、24和30 h分别增长3.47、5.84、1.75、3.69和5.41倍，差异均有统计学意义（1 h：P=0.014 7，6 h：P=0.003 3，12 h：P=0.014 7，24 h：P=0.003 0，30 h：P=0.003 0）（图 3C）。腹腔注射LPS小鼠灌胃给予TQ016后1、6、12、24和30 h，被LPS上调的IDO1活性分别下降36.67%、43.46%、51.70%、45.90%和51.61%，在6、12、24和30 h差异有统计学意义[6 h：P=0.0159；12 h：F（3，4）=3.971，P=0.005 2；24 h：F（3，5）=1.886，P=0.004 8；30 h：F（5，4）=1.835，P=0.000 5]（图 3C）。以上结果再次说明腹腔注射LPS用于上调小鼠血清中IDO1活性的可行性，此小鼠模型适用于IDO1抑制剂的药效动力学评价。IDO1抑制剂TQ016具有良好的IDO1活性抑制作用。

不同剂量TQ016对腹腔注射LPS小鼠IDO1活性的抑制作用  与对照组相比，LPS组小鼠血清中Trp含量下调（图 4A），Kyn含量上调（图 4B），IDO1活性显著上调（1 h：P=0.009 0，6 h：P=0.001 4，12 h：P=0.037 7，24 h：P=0.006 1，30 h：P=0.002 1）（图 4C）。TQ016对LPS下调的Trp含量无明显影响（图 4A）。当TQ016为100 mg/kg时，灌胃给予1、6、24和30 h后，被LPS上调的Kyn含量显著降低[1 h：F（3，3）=10.100，P=0.030 3；6 h：F（3，4）=2.812，P=0.039 4；24 h：F（4，3）=8.392，P=0.0208；30 h：F（5，4）=1.493，P=0.000 2]（图 4B）。不同剂量TQ016灌胃1、6、12、24和30 h后，被LPS上调的IDO1活性均不同程度下降且呈剂量效应。当TQ016为100 mg/kg时，灌胃给予1、6、12、24和30 h后，被LPS上调的IDO1活性均显著降低[1 h：P=0.028 6；6 h：F（3，4）=1.662，P=0.008 4；12 h：F（4，2）=2.290，P=0.012 4；24 h：F（4，3）=12.560，P=0.002 0；30 h：F（5，4）=2.114，P=0.000 5]（图 4C）。以上结果说明IDO1抑制剂TQ016具有良好的IDO1活性抑制作用并呈剂量效应。

Naïve鼠用于IDO1抑制剂药效动力学评价一般采用单次给药，如naïve C57BL/6小鼠单次皮下注射100 mg/kg IDO1抑制剂5I，血清中Kyn含量从（1.10±0.17）μmol/L下降到（0.45±0.20）μmol/L[15]，naïve C57BL/6小鼠单次灌胃给予50 mg/kg IDO1抑制剂INCB024360，血清中Kyn含量从给药前约1.50 μmol/L下降到给药8 h后的0.50 μmol/L左右[16]。因此，实验耗时短。但是，naïve鼠处于正常生理状态，本底IDO1活性较低。LPS可诱导炎症反应，上调小鼠体内IDO1活性。

本研究使用尾静脉注射和腹腔注射两种方式给予小鼠LPS。尾静脉注射需要将老鼠固定、鼠尾拉直，注射时的进针角度尽量平行于鼠尾。与尾静脉注射相比，腹腔注射相对容易操作。实验结果发现尾静脉注射0.66 mg/kg LPS或腹腔注射5 mg/kg LPS均可显著上调小鼠血清中IDO1活性，适用于造模。其中，LPS诱导前昆明鼠本底的Trp、Kyn含量以及（Kyn/Trp）×100为80.00~90.00 μmol/L、1.00 μmol/L和1.30，诱导后为50.00~60.00 μmol/L、1.50~2.00 μmol/L和3.00~4.00。LPS诱导前C57BL/6小鼠本底Trp、Kyn含量以及（Kyn/Trp）×100为100.00~150.00 μmol/L、0.30~1.30 μmol/L和0.30~0.90，诱导后为70.00~100.00 μmol/L、2.00~4.00 μmol/L和2.00~4.00。两种小鼠本底Trp、Kyn含量以及（Kyn/Trp）×100相近，LPS可上调两种小鼠血清中IDO1活性。

与naïve鼠相比，LPS诱导的小鼠具有较高的IDO1活性。与构建荷瘤小鼠相比，使用LPS诱导小鼠实验操作简单易行，无需进行细胞培养、传代以及细胞皮下接瘤等实验操作，只需为小鼠尾静脉注射或腹腔注射LPS，即可短时间内显著上调小鼠血清中IDO1活性。实验耗时明显短于构建荷瘤小鼠所需时间，节省了大量的时间、人力成本。LPS将体内（Kyn/Trp）×100从0.50左右上调至1.80~2.60，具有与荷瘤小鼠相当甚至较高的IDO1活性。因此，LPS诱导构建的急性炎症小鼠模型适用于IDO1抑制剂药效动力学评价。

接下来，我们评价了IDO1抑制剂L-1-MT和TQ016的药效动力学。采用尾静脉注射LPS造模时，我们检测了IDO1抑制剂在短时间内（40 min、2 h、4 h）的药效动力学效果；采用腹腔注射LPS建模时，我们检测了L-1-MT在4、12 h的药效动力学效果，以及TQ016在长时间内（≤30 h）的药效动力学效果。实验结果发现L-1-MT和TQ016在灌胃给予2 h后对尾静脉注射LPS小鼠具有明显的IDO1活性抑制作用。与此类似，有研究表明naïve小鼠腹腔注射100 mg/kg IDO1抑制剂5I，给药后2.5 h达到最大的血清Kyn抑制效果[15]。腹腔注射LPS小鼠灌胃给予L-1-MT 4 h后，被LPS上调的IDO1活性显著下降；灌胃给予TQ016后1、6、12、24和30 h，被LPS上调的IDO1活性分别下降了36.67%、43.46%、51.70%、45.90%和51.61%（37%~50%），并且在6、12、24和30 h这些时间点具有显著性。一些处于临床试验阶段的IDO1抑制剂的动物水平的药效动力学研究也有报道，如口服20 mg/kg NLG919可将乳腺癌4T1荷瘤小鼠血清中IDO1活性下调50%左右[18]，腹腔注射80 mg/kg Epacadostat可将肺癌LLC荷瘤小鼠血清中IDO1活性下调50%左右[19]。本实验的结果表明TQ016和这些IDO1抑制剂具有水平相近的IDO1活性抑制作用。最后，我们选用25、50和100 mg/kg这3种不同的TQ016灌胃剂量。实验结果发现TQ016对LPS上调的小鼠血清中IDO1活性具有抑制作用并呈剂量效应。

综上，尾静脉注射0.66 mg/kg LPS或腹腔注射5 mg/kg LPS均可短时间内显著上调小鼠血清中IDO1活性。构建该动物模型仅需尾静脉注射或腹腔注射LPS，实验操作相较于构建荷瘤小鼠简单易行，实验耗时短，且LPS上调的IDO1活性与荷瘤小鼠IDO1活性相当。因此，LPS诱导的小鼠模型适用于IDO1抑制剂的药效动力学评价。利用该模型对IDO1抑制剂TQ016进行药效动力学评价，结果发现TQ016和目前处于临床试验的IDO1抑制剂具有相当的IDO1活性抑制作用，并呈剂量效应。本研究可为IDO1抑制剂的研究提供一个科学、高效的研究工具，有助于IDO1抑制剂的新药研发。

作者贡献声明    施磊  实验操作，数据统计和分析，论文构思和撰写。郭磊磊，杨丹  实验操作，数据收集。杨青  论文构思和撰写。

利益冲突声明  所有作者均声明不存在利益冲突。