一、实时荧光定量PCR的概念

什么是QPCR？实时荧光定量PCR检测技术是指在PCR反应体系中加入可与DNA产物异形结合的荧光基团，利用荧光信号积累监测整个PCR过程，最终通过相对定量和绝对定量的方法确定各个样本的表达量。

二、QPCR实验的应用及分类

关于QPCR绝对定量和相对定量的应用，绝对定量技术通常在病原体检测、转基因食品检测以及基因表达研究中应用比较广泛；相对定量应用于mRNA表达量分析、siRNA干扰效果的验证和基因过表达以及基因芯片效果的验证。

三、QPCR技术的两大分类优缺点对比

四、实时荧光定量PCR的实验步骤：

1、样本制备；

2、RNA提取；

3、反转录；

4、QPCR引物设计及预实验；

5、实时荧光定量QPCR数据分析。

五、QPCR实验技术有哪些注意事项

1、扩增曲线和熔解曲线

  对于QPCR实验中涉及到的扩增曲线和熔解曲线需要做如下的要求，由于扩增曲线是反映PCR循环数与荧光强度的一条曲线，所以这条曲线要平滑完整，而熔解曲线是将温度与荧光强度的变化求导得到是对数图谱，所以要求熔解曲线是单一峰；

2、Ct值

同样是QPCR实验中需要注意的重要参数，它是PCR扩增过程中，扩增产物的荧光信号达到设定阈值时所经过的扩增循环次数，也就是说，我们达到一个平台期的时候，Ct值的起始value与平台期之间存在一个Ct循环数的差异，我们称之为该基因的扩增倍数。经过了多少个循环数达到平台期所求出来的差值就是我们的Ct值。其特点是DNA模板量越多，达到荧光阈值的循环数越少，所以Ct值越小。

  如图所示，它的Ct value越偏向于右边，它的起始模板量越少，越偏向于左边，起始模板量越高。而它们最终都是要达到一个平台期的。

3、反应体系配置

  配置体系时需要注意以下几点：

  ①SYBR MasterMix不要反复冻融；

  ②在一个管中配置Mix，减少加样误差；

  ③所有成分加完后，离心去除气泡；

  ④每个样品至少3-4个平行孔，方便进行统计学分析；

  ⑤需设置NTC阴性对照组，验证实验材料是否具有污染。

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