本发明涉及dna提取技术领域，尤其涉及一种酵母基因组提取的的细胞裂解液、含有该裂解液的试剂盒以及使用该试剂盒提取酵母基因组的方法。

背景技术：

酵母因其遗传背景清楚、操作简便、生长快速等特点，常常作为真核基因组表达的模式体系。此外，酵母还广泛用于基因工程和食品生产。在研究酵母过程中，提取其基因组进行目的基因的检测是重要的一步。

酵母细胞壁坚韧厚实，厚度为0.1-0.3μm，重量占细胞干重的18％-30％，具有维持细胞形态和细胞间识别的重要作用。它的结构类似于三明治。外层是甘露聚糖，中间是蛋白质分子层，内层是葡聚糖。外层的甘露聚糖主链以α-1,6糖苷键结合，支链以α-1,2或α-1,3糖苷键结合，内层的葡聚糖以β-1,3糖苷键结合，形成网状结构，维持细胞壁的强度和韧性，在正常渗透压下可大量延伸。因此有效地破除酵母的细胞壁是成功提取酵母基因组的关键。

目前，酵母基因组的提取成本高、耗时长、品质差，因此，亟需一种改进优化的酵母基因组提取方法及相关产品。

技术实现要素：

针对现有技术的不足，本发明提供了一种用于酵母基因组提取的细胞裂解液、试剂盒和方法。

为实现上述目的，本发明采用以下技术方案：

本发明的第一方面是提供一种用于酵母基因组提取的细胞裂解液，包括的组分及其含量如下：异硫氰酸胍50～60g/l，tris-base1～10g/l，edta·2na8～15g/l、吐温-201～10％。

进一步地，上述细胞裂解液包括的组分及其含量如下：异硫氰酸胍54.2g/l，tris-base3.6g/l，edta·2na9.4g/l，吐温-202％。

本发明的第二方面是提供包括上述细胞裂解液的用于酵母基因组提取的试剂盒。

进一步地，上述试剂盒还包括山梨醇缓冲液、sds缓冲液、溶壁酶溶液、rnasea溶液、蛋白酶k溶液和7u吸附柱。

进一步地，山梨醇缓冲液的浓度为0.1g/ml。

进一步地，sds缓冲液的浓度为0.8％。

进一步地，溶壁酶溶液的浓度为10mg/ml。

进一步地，rnasea溶液的浓度为15mg/ml。

进一步地，蛋白酶k溶液的浓度为20mg/ml。

本发明的第三方面是提供采用上述试剂盒的用于酵母基因组提取的方法，包括如下步骤：

步骤一，取过夜培养的酵母菌液，离心，收集菌体；向收集的菌体中依次加入山梨醇缓冲液和溶壁酶溶液，充分混匀并温育20-40分钟；

步骤二，离心，弃上清；向沉淀中加入sds缓冲液重悬沉淀，然后加入rnasea溶液，充分混匀，室温放置3-10分钟；

步骤三，加入细胞裂解液，混匀，再加蛋白酶k溶液混匀，在60-80℃条件下保温；

步骤四，冷却至室温，加入无水乙醇，充分混匀后加到7u吸附柱上；

步骤五，离心，弃去收集管中的废液，加入80％乙醇溶液，离心，取下吸附柱，弃去收集管中的废液；

步骤六，重复上述步骤五；离心以去除残留的乙醇；将吸附柱放入新的洁净的离心管中，在吸附柱中央加入50～100μlte缓冲液，室温或37℃放置；

步骤七，离心，离心管中的液体即为酵母基因组。

进一步地，酵母菌液的密度不超过2.5×107cells/ml；所述酵母菌液、山梨醇缓冲液、溶壁酶溶液、sds缓冲液、细胞裂解液、蛋白酶k溶液的体积比为1:0.2-0.8：0.0025-0.005：0.05-0.3：0.1-0.2：0.01-0.02。

进一步地，上述方法使用的rnasea溶液、无水乙醇和细胞裂解液的体积比为0.01-0.02：1：1。

进一步地，步骤一中温育的条件为30℃，30分钟。

本发明采用以上技术方案，与现有技术相比，具有如下技术效果：

(1)细胞裂解液中含有异硫氰酸胍和吐温-20，sds缓冲液含有sds，有利于细胞裂解，缩短提取是裂解的时间，提取dna的效果更佳；

(2)本发明提供的方法简化了操作步骤，步骤二中产生的上清液可直接倒出，避免了用移液枪吸取上清液，简单快捷，节省工时、节约枪头费用；

(3)避免使用毒性气味较高的氯仿，减小对操作人员的健康伤害；

(4)提取物中dna产量高、含量也较高，特别是结合了7u吸附柱的使用，使dna中的蛋白质和盐去除得很干净，提高了所提取dna的品质；

(5)结果相当稳定，成功率高，适合大规模提取dna。

综上所述，本发明提供的酵母基因组提取试剂盒比现有技术省时、省力，裂解细胞彻底，实验过程中避免使用了氯仿，减少对实验操作人员的伤害。提取出的基因组产量高，可直接用于后续实验，无需再对基因组进行纯化。

附图说明

图1显示了采用实施例5提供的方法以及对比例1提供的方法所得的基因组的琼脂糖凝胶电泳的结果；其中，1-6孔是比较例1提取的dna，7-12孔是实施例5提取的dna；m是上海捷瑞生物工程有限公司的dnamarkerdl2502。

具体实施方式

本发明提供了一种用于酵母基因组提取的细胞裂解液、试剂盒和方法。该细胞裂解液包括的组分及其含量如下：异硫氰酸胍50～60g/l，tris-base1～10g/l，edta·2na8～15g/l、吐温-201～10％。

下面通过具体实施例和附图对本发明进行详细和具体的介绍，以使更好的理解本发明，但是下述实施例并不限制本发明范围。

实施例中方法如无特殊说明的采用常规方法，使用的试剂如无特殊说明的使用常规市售试剂或按常规方法配制的试剂。

实施例1

本实施例提供了一种用于酵母基因组提取的细胞裂解液，包括的组分及其含量如下：异硫氰酸胍54.2g/l、tris-base3.6g/l、edta·2na9.4g/l、吐温-202％。

实施例2

本实施例提供了一种用于酵母基因组提取的细胞裂解液，包括的组分及其含量如下：异硫氰酸胍60g/l、tris-base2.4g/l、edta·2na12g/l、吐温-205％。

实施例3

本实施例提供了一种用于酵母基因组提取的细胞裂解液，包括的组分及其含量如下：异硫氰酸胍50g/l、tris-base4.2g/l、edta·2na5.4g/l、吐温-201％。

实施例4

本实施例提供了包括实施例1的细胞裂解液的用于酵母基因组提取的试剂盒，其还包括如下浓度的试剂和器材：0.1g/ml的山梨醇缓冲液，0.8％的sds缓冲液，10mg/ml的溶壁酶溶液，15mg/ml的rnasea溶液，20mg/ml的蛋白酶k溶液和7u吸附柱。

实施例5

本实施例提供一种采用实施例4提供的试剂盒的用于酵母基因组提取的方法，其包括如下步骤：

1)取15个过夜培养的2ml酵母菌液(最多不超过5×107cells)，加入至2ml离心管中，室温8,000rpm离心1分钟，尽量吸除上清，收集菌体。

2)向菌体中加入600μl山梨醇缓冲液，加入5μl溶壁酶溶液，充分混匀，30℃温育30min，期间最好每隔5分钟混匀1次。

3)8,000rpm离心5min，弃上清，收集沉淀，残余溶液尽量去完全。

4)向沉淀中加入200μlsds缓冲液重悬沉淀，加入4μlrnasea溶液，充分混匀，室温放置5分钟。

5)加入220μl细胞裂解液，混匀，再加20μl蛋白酶k溶液混匀，70℃保温10分钟。

6)待样品冷却接近室温，加入220μl无水乙醇，充分混匀，如有沉淀，不影响提取，用枪头打匀，直接加到7u吸附柱上。

7)8,000rpm室温离心1分钟；取下吸附柱，弃去收集管中的废液，加入500μl80％乙醇溶液，8,000rpm，室温离心1分钟；取下吸附柱，弃去收集管中的废液。重复步骤7一次。

8)将吸附柱放回收集管中，12,000rpm，室温离心1分钟，以去除残留的乙醇。

9)将吸附柱放入新的洁净的1.5ml离心管中，在吸附柱中央加入50～100μlte缓冲液，室温或37℃放置2分钟。

10)12,000rpm，室温离心1分钟。离心管中的液体即为基因组dna。根据用途，样品可以4℃或-20℃保存。

对比例1

对于15个过夜培养的2ml酵母菌液样本，使用其他品牌的酵母基因组提取试剂盒(天根dp307)并按照试剂盒的说明书进行提取。

验证实施例1

本实施例对采用实施例5提供的方法以及对比例1提供的方法所得的基因组进行dna质量检测，具体是采用琼脂糖凝胶电泳对基因组进行电泳(结果如图1所示)和采用紫外分光光度计测定od值(结果如表1所示)。

其中，根据od值判定质量的原理为：由于dna在260nm处有最大的吸收峰，蛋白质在280nm处有最大的吸收峰，盐和小分子则集中在230nm处，故可用260nm波长进行分光测定dna浓度；双链dna的260nmod值为1.0时所对应的dna浓度为50μg/ml，dna纯品的od260/od280为1.8，故根据od260/od280的值可以估计dna的纯度；优质dna的od260/od280比值为1.70～2.0；若比值较高说明含有rna，比值小于1.80，说明存在蛋白质或酚等杂质。od230/od260比值应在0.4～0.5之间，若比值较高说明有残余的盐存在。根据所测样本的od值计算dna纯度(od260/od280比值)、dna杂质含量(od260/od230比值)和dna浓度(50μg/ml×od260×稀释倍数/1000)。

表1浓度测定结果

由上述结果可知，本发明提供的方法提取的酵母基因组浓度和纯度较高且符合后续实验要求。

以上对本发明的具体实施例进行了详细描述，但其只是作为范例，本发明并不限制于以上描述的具体实施例。对于本领域技术人员而言，任何对本发明进行的等同修改和替代也都在本发明的范畴之中。因此，在不脱离本发明的精神和范围下所作的均等变换和修改，都应涵盖在本发明的范围内。