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RNA和DNA的分子结构示意图 图片来源:wikipedia 新冠病毒的遗传物质为RNA,由此归属为RNA病毒。RNA的单链结构更容易发生变异(也可以理解为进化),此次的新冠病毒其实也是经历了大量排列组合的“历练”以及“层层筛选”,最终“机缘巧合”地进化出兼具高度传染性和致病性的特点。 (二)核酸检测是什么 核酸检测顾名思义就是针对核酸开展检测。 核酸检测有何独特的优势呢?为何能作为新冠病毒确诊的“金标准”呢? 其实每一种检测方法都有其擅长的应用场景。以病毒检测为例,通常的免疫学检测方法(胶体金、ELISA、化学发光等)的检测对象是病毒的抗原或抗体,相当于“侧面描绘”。由于从感染到可检测存在一个时间窗口期,因此免疫学检测方法一般不合适作为早期诊断。 补充知识: 从机体对新冠病毒的体液免疫应答来看,新冠病毒的S蛋白、N蛋白等会刺激免疫系统引起抗体应答,随后出现IgM抗体、IgA抗体、IgG抗体。遵从急性感染的一般过程,当IgG抗体出现后,IgM持续降低直至消失,IgG浓度会持续增加并较长时间存于血清中。但是IgM和IgG需要感染一段时间后才会产生。 而核酸检测的检测对象是病毒的遗传物质,则是“正面追击”。理论上只要有一个病毒就可以检测到,因此核酸检测很合适作为早期诊断。而且核酸检测可以针对病毒遗传物质中特定的特异性区域,因此特异性很高,一旦检测到,则可以判断为阳性。 及早地确诊疑似患者对抗击新冠病毒疫情至关重要。而核酸检测正是兼具合适早期诊断以及高度特异性的优点,从而成为了此次确诊感染的“金标准”。 核酸检测主要包括核酸电泳、核酸杂交、聚合酶链式反应(polymerase chain reaction, PCR)、基因芯片、基因测序等。其中,PCR技术由于操作方便、可以快捷地获得定性或定量检测结果,是科研和临床中广为使用的一种核酸检测方法。 二 步入正题:PCR原理 PCR技术由Kary Mullis于1988年首创,技术上实现了在体外模拟发生于细胞内的DNA快速扩增特定基因或DNA序列复制的过程。随着技术的发展,PCR已经衍生出很多不同的细分技术,例如quantitative PCR、multiplex-PCR,variable number of tandem repeats (VNTR) PCR,asymmetric PCR,nested PCR,touchdown PCR,digital PCR等等。 这么多技术,其实都绕不开最基本的PCR原理。 (一)PCR的基本过程 PCR一般会经历多轮温度循环,其中每一轮温度循环包括变性(denaturation)、退火(anealing)和延伸(elongation)三步。 变性是在高温(95℃左右)条件下,DNA模板双链打开的过程,使之能够与引物结合,为下面的反应做准备。退火是在冷却后(一般在68℃左右),变性后的DNA单链与引物通过碱基互补配对(A-T、C-G),再次形成局部双链。延伸是在DNA单链模板与引物特异性结合(俗称“接头”)之后,于72℃左右的温度下TaqDNA聚合酶发生作用,以脱氧核糖核苷三磷酸(deoxy-ribonucleoside triphosphate, dNTP,主要包括dATP、dUTP、dTTP、dCTP、dGTP)为原料,以靶向序列为模板,碱基互补配对为原则,再次合成完整的双链DNA的过程。经过延伸复制之后,有一条链是新合成的,另一条则是原有模板,于是此种复制方式称为半保留复制(semiconservative replication)。 通过多轮温度循环,初始少量的DNA模板以“一变二、二变四”这样的指数扩增方式,最终得到大量复制的DNA模板产物。 PCR原理示意图 图片来源:wikipedia PCR原理动态示意图 图片来源:https://gifimage.net/pcr-gif-4/ (二)PCR反应的组成成分 PCR反应的组成成分主要包括检测模板(DNA template)、引物(primer)、Taq酶、dNTP、缓冲液(buffer)。 PCR的组成成分 图片来源:Genetic Education Inc. 1、模板 模板一般为DNA,有时也称底物。在检测过程中,首先使用提取/纯化试剂盒将血液等样品中的全部核酸给提取出来,而待检的DNA模板则“混迹”于其中。 2、引物 引物通常是人工合成的两段寡核苷酸序列,其功能是作为核苷酸聚合作用的起始点,核酸聚合酶可由其3’-端开始合成新的核酸链。 3、dNTP dNTP主要包括dATP、dUTP、dTTP、dCTP、dGTP,dNTP是PCR扩增所需的基础原料。 4、酶 DNA聚合酶是PCR反应中的关键成分,其主要在延伸步骤中发挥作用。由于PCR中的延伸步骤一般在72℃左右进行,因此反应体系中的DNA聚合酶需在该高温下仍保持高效的活性。筛选合适的酶对提升反应效率、节约反应时间是最为直接有效的手段。最经常使用的便是从水生栖热菌 Thermus Aquaticus 中分离出的具有热稳定性的DNA聚合酶,简称Taq酶。 5、缓冲液 缓冲液为反应提供了均质稳定的反应环境,成分较为复杂。主要包括缓冲体系、Mg2+、辅助成分(维持酶的活性)等。 三 渐入佳境:逆转录PCR与荧光PCR PCR相当于一个“放大器”,让我们有能力检测到微量或痕量DNA的踪迹。但实际检测中,并非所有的待检样本为双链DNA,例如新冠病毒的遗传物质便是单链RNA。 此时对于这类单链RNA将如何检测呢?在“看到”模板是否存在的基础上,是否可以“测量”模板多少呢? 这便衍生出逆转录PCR(reverse tranion-PCR, RT-PCR)和实时荧光定量PCR(realtime-PCR,常简称为荧光PCR、缩写为qPCR)技术。 (一)逆转录PCR RNA是个单链,为了使用PCR手段对其进行检测,关键在于将RNA变成双链。 于是,RT-PCR则是先将单链RNA逆转录为双链cDNA(complementary DNA),然后再以cDNA为模板,历经PCR过程。 (二)荧光PCR 理论上,经典PCR中DNA模板的扩增遵循指数增长规律,但受限于实际反应条件,经过多轮循环后,PCR反应将进入“平台期”而产生偏离。对经典PCR终点的DNA模板进行检测,本质上仍是一种定性或半定量检测,可以用于判断待测核酸模板是否存在、以及相对含量多少 。 而realtime-PCR则实现了从定性检测向定量检测的飞跃。产生飞跃的关键因素,是在经典PCR中加入了荧光物质,通过实时检测荧光强度实现实时监测PCR过程(在一段区间范围内,荧光强度与模板数量呈正向线性关系)。根据荧光物质的特异性不同,可分为非特异性的荧光染料以及特异性的荧光探针两大类。 随着PCR的进行,可以绘制得出荧光信号强度随循环次数(测试时间)的一条曲线。 荧光信号强度-循环次数的曲线示例图 图片来源:wikipedia 对于所检测得到的弯曲曲线,如何对曲线进行定量分析呢? 关键在于定义一个荧光阈值(threshold)。所定义的threshold对应的循环阈值( C t)与初始模板的数量多少息息相关,简单来说, C t与初始模板数量呈现负相关关系。 有兴趣的可以看以下推导过程: 定义n为循环次数,X0为初始模板数量,Xn为第n次循环后的模板数量,E为扩增效率。对于一个PCR过程,则满足 Xn= X0(1+E)n 其中,Xn与荧光信号强度满足正相关关系。 对于设定的threshold为一个常数K,则满足 XCt= X0(1+E)Ct= K 可推导出 lgX0= -Ctlg(1+E)+lgK 或 Ct= -lgX0/lg(1+E) + lgK/lg(1+E) 其中,对于一个特定的PCR过程,E和K均为常数,由此, X0与Ct为负相关关系。也即Ct越低,代表初始模板数量越高。 举一个小例子,让大家相对直观地感受一下初始模板数X0与Ct两者间的负相关关系。 某个试剂盒的扩增效率为100%,标准样品中含有100 个模板,对于设定的threshold,标准样品对应的 Ct,std为25.000 ;假设有两个未知样品(待测模板与标准样品的模板相同),样品A测试结果为 Ct,A为21.678 ,样品B测试结果 Ct,B为28.322 。那样品A和样品B分别对应多少个模板数呢? 计算结果如下: K = XCt= 100×(1+1)25= 100×225 或 lgK ≈ 9.526 则对于样品A, lgX0,A= -Ctlg(1+E) + lgK = -21.678×lg2 + 9.526 或 X0,A= 10-21.678×lg2 + 9.526≈ 1000 则对于样品B,可同理计算得到 X0,B= 10-28.322×lg2 + 9.526≈ 10 由此,可以相对直观地认识到初始模板数X0与Ct两者间的负相关关系。 (三)逆转录PCR联手荧光PCR 通过联合逆转录PCR和荧光PCR技术,则衍生出实时荧光逆转录聚合酶链式反应(realtime reverse tranion PCR, qRT-PCR)技术,由此可以对单链RNA进行定量检测。 为了检测新冠病毒的RNA,最合适的便是qRT-PCR了,由此也作为推荐检测方法写入了《新冠诊疗方案第七版》 。 四 实战演练:PCR用于病毒核酸检测 (一)判定标准 不同的qRT-PCR试剂盒的技术参数不同,具体的判定标准可能有微小差异,差异主要在于 C t的大小。 举个例子,假设某个或批的qRT-PCR试剂盒,循环数为40,选取参考 C t为37。 则当 C t为40或不存在时,判定为阴性。 当 C t |
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