活性氧（ROS）的定量检测（使用酶标仪）

    因为没有在b站看到关于使用酶标仪做的定量活性氧检测教程，现在自己来尝试着弄一篇，也可以在以后提醒自己，方便回看，如果大家有什么意见或建议都可以在评论区提出，我都会看的，谢谢大家。

第三天器械准备：超净台紫外，EP管离心机，37°C水浴锅（热培养基、胰酶之类的）、枪头。

第三天材料准备：PBS、胰酶、完全培养基（含10%FBS、1%双抗的DMEM培养基）、EP管多个、DCFH-DA、锡纸（遮光用的）。

    第一步 铺板（师姐教的是用六孔板，但是我已经铺了96孔板，就先写96的，也差不多）

    铺板：我才用的是贴壁细胞HepG2，用的培养基是DMEM，平时养细胞用的是完全培养基（含10%FBS、1%双抗的DMEM培养基），我的铺板密度是：8*10^4个/ml（使用计数板计数），每个孔100微升，打入板中后先去镜下观察，再决定要不要十字摇匀（我感觉一般96孔板不用怎么摇就很匀了）。我的药物总共有四个浓度，但是我因药物溶剂有毒性，多设置了一个对照组（含溶剂），所以算上对照组共六个组，我铺六列。

第二步 上药

    铺板后，等细胞完全贴壁其实就可以上药了，但是我因时间有限，每次都只能24h后处理，所以只能铺8000个/100微升，次日再处理时基本上长得比较均匀而且不是很密集，略有空隙。我根据我设置的六个组，配好最高浓度药物和对照组（含溶剂），之后就可以用等比稀释的方法加好4个药物浓度以及对照组和对照组（含溶剂），我吸去原培养基，再加配好的进去（实际药物浓度与我写在板上标记的一样）。

第三步 做ROS定量检测

    这时候一般是第三天了（第一天铺板，第二天上药），我目前决定具体步骤如下：

    先记得解冻DCFH-DA，我们实验室的话，解冻后是直接按1：1000配到无血清的DMEM培养基里，用锡纸遮光备用。

一、保留原培养基

分别吸取各组孔中培养基到EP管内（我的有六个组，就六个EP管）

二、消化

1、在96孔板各孔中加入50微升胰酶，孵育一定时间，如两分钟后观察一下镜下状况，没有消化下来就再孵育

    这里我没有像平时一样先用PBS洗涤，因为我觉得可能会把悬浮细胞洗掉...

2、终止消化（在96孔板各孔中加入100微升含10%FBS、1%双抗的DMEM完全培养基，即胰酶的两倍体积）

3、适当吹打孔中细胞（把可能还没有消化下来的也吹打下来，保证细胞都下来了），吸取孔中液体，加到各组EP管内（我的六个组，每个组的EP管最后会有大概1.5ml液体）

4、离心5min（转速待定，暂时不知道设置多少，平时用的是1500r/min）

这个时候可以在96孔板原来各孔中加入100微升PBS，保持湿润。

5、弃上清

三、洗涤

1、用PBS重悬（每组1ml）

2、离心5min

3、弃上清

四、第二次洗涤

1、用PBS重悬（每组1ml）

2、计数（这里需要记录各组细胞密度，先计数高浓度药物组，因为他的细胞应该是最少的，全部计数后，根据最少细胞的组将其他各组细胞悬液吸去，并补入等量PBS，从而使得各组细胞数相等、溶液体积也相等）

3、离心5min

4、弃上清

五、染色

1、用前面配好的DCFH-DA溶液重悬（每组1ml）

2、将EP管放在一起，注意用锡纸遮光，孵育20-30min（我一般20-25min吧，每隔3-5min颠倒混匀）

3、离心5min

4、弃上清

六、染色后洗涤

1、用无血清的DMEM培养基重悬（每组1ml）

2、离心5min

3、弃上清

七、染色后再次洗涤

1、用PBS重悬（每组1ml）

2、离心5min（此时可以去把酶标仪开起来）

3、弃上清

八、打回孔中

1、用PBS重悬（每组1ml）

2、吸去96孔板各孔中PBS

3、将重悬后的各组打回孔中

九、酶标仪读数

1、放好板后，选择进板，新建一个文件

2、设置板布局（根据自己布局设置即可）

3、荧光参数，激发波长488nm，发射波长525nm，顶读，激发带宽12nm

4、设置保存结果的文件夹

大致步骤就是以上这样，大家要是有什么意见或建议都可以提出，另外要是具体想针对某一个地方的话可以加上第几步第几点第几小点，比如第三步第八点第1小点这样子，谢谢你的阅读。

附：

1、在网上查到的（忘记哪里查到的了）关于顶读、底读的区别：细胞悬液、悬浮细胞可以用顶读，贴壁细胞荧光可以用底读，但是因为我要保证每个孔细胞数一致，所以只能悬浮再计数，将细胞数量控制为相同再继续，所以只能用顶读了。

2、激发带宽：

（忘记在哪里找到的相关资料了...）

发射波长-激发波长>24nm，激发带宽设置为12nm；

17nm