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专利名称：快速获得棉花转基因植株的方法
技术领域：本发明属于植物分子生物学技术领域，与植物转基因技术有关。
发明目的本发明的目的在于克服已有技术的不足，建立一种快速获得棉花转基因植株的方法，利用该方法对棉花转基因植株进行早期快速鉴定，筛选所需要的棉花转基因植株。
采用以下技术步骤(1)取棉花下胚轴，消毒，或制备无菌下胚轴切段，创造切口，将生长到对数期的农杆菌侵染10-15min，吸干菌液，共培2-3天；(2)将步骤(1)所述的材料转入加有1mg/L烟酸，20mg/L维生素B1，2mg/L维生素B6，30g/L葡萄糖，头孢噻胯(cefotaxim)和卡那霉素或加头孢噻胯和潮霉素(Hggromycin)，0.1mg/L 2，4-D，0.1mg/L kinetin的MSB5培养基上进行选择培养6-8周；(3)通过荧光体视显微镜观察步骤(2)中材料的绿色荧光蛋白基因(GFP)或GUS基因的表达；(4)将步骤(3)中得到的材料在去除植物激素的改良MSB5培养基上再生培养8-12周；(5)将步骤(4)所得到的材料转移到生根培养基上诱导生根，然后移栽至田间，或将步骤(4)得到的材料嫁接到具有1-2片真叶的棉苗上；(6)将步骤(5)得到的材料进行田间鉴定。
将10-50mg/L卡那霉素，或5U/L潮霉素加入到选择转化体培养基上，通过荧光显微镜观察转化体中GFP基因或GUS基因表达，快速鉴定转化体。
将转基因苗转移到加有0.1mg/L IAA，0.1mg/L，，kinetin，0.1mg/L赤霉酸(GA3)的Hsu生根培养基上培养，生根后的小苗再转移到灭菌的花房土中栽培。或者，将组织培养所获得的材料通过嫁接到1-2片真叶的棉苗上并转移到田间栽培。
上述方法中种子消毒采用0.1％升汞，浸泡去壳后的棉种8-10分钟，然后用70％酒精浸泡3分钟，在MS培养基(加蔗糖20g/L)上无菌发芽，制备下胚轴切段。用于共培和选择的培养基均为商品培养基(MS)，补加B5培养基的维生素成分1mg/L烟酸，维生素B120mg/L，维生素B6 2mg/L，葡萄糖30g/L。用于选择转化体的抗生素，若为卡那霉素浓度为10-50mg/L，若为潮霉素，浓度为5个国际单位/L，转化体快速鉴定时，若报告基因为GFP基因，可采用荧光体视显微镜直接观察；若为GUS基因，则采用常规方法观察(CellA Laboratorymanual，D.L.Spector等1997)。生根培养基为Hsu(Stewart，J and Hsu，G.，1977，Planta137113-117)，补IAA0.1mg/L，kinetin 0.1mg/L，赤霉酸(GA3)0.1mg/L；生根后的小苗再转移到灭菌的花房土中栽培，7日内避免植株蒸发。若进行嫁接，选取具1-2片真叶的棉苗，去顶，保留子叶，用小刀从中劈开，将接穗修整成契形插入接口中，用棉线扎紧，封闭7日后再移栽到钵内，4周后去除包扎。发明效果按照上述方法可在4～6个月内获得棉花转基因植株，解决了棉花组织培养过程中分化难的问题。本发明的方法操作简便，转化效率高，分化成苗率大于90％，获得转化植株的效率为60-70％，这比Umbeck P.等(1987)，Gould J.H.h和Magallances-Cedeno M.(1999)所用的方法在转化棉花的过程中获得3％和5％左右的转化效率分别高出近20倍和10倍。因此，有效地解决了棉花转化后形成再生植株困难的问题，不受棉花基因型的影响，而且周期较短，为棉花和其它难以再生的植株的转基因研究开辟了广阔前景。
图1是本发明观察GFP基因在叶片保卫细胞中表达的结果；图2和图3是本发明观察GFP基因在叶片栅栏组织中表达的结果；图4，是本发明培育的棉花转基因试管苗；图5，是本发明培育的转基因植株。
本发明已从6个不同棉花品种中获得400余株转基因植株，每批转基因植株的获得不超过6个月。
本发明的对比效果如表1所示表1不同转化方法、不同品种对获得棉花转基因植株效率的比较
权利要求
1.一种快速获得棉花转基因植株的培育方法，含有MS和B5培养基，其特征在于，所述的培养基采用改良的MSB5培养基，该培养基添加有维生素B1、B6、烟酸以及植物生长激素，将无菌棉花下胚轴切段在所述的培养基上培养，通过直接诱导芽生成而不是通过诱导胚状体生成的途径，获得转基因棉花植株。
2.根据权利要求1所述的快速棉花转基因植株的培育方法，其特征在于，采用以下技术步骤(1)取棉花下胚轴，消毒，或制备无菌下胚轴切段，创造切口，将生长到对数期的农杆菌侵染10-15min，吸干菌液，共培2-3天；(2)将步骤(1)所述的材料转入加有1mg/L烟酸，20mg/L维生素B1，2mg/L维生素B6，30g/L葡萄糖头孢噻胯(cefotaxim)和卡那霉素或加头孢噻胯和潮霉素(Hggromycin)，0.1mg/L 2，4-D，0.1mg/L kinetin的MSB5培养基上进行选择培养6-8周；(3)通过荧光体视显微镜观察步骤(2)中材料的绿色荧光蛋白基因(GFP)或GUS基因的表达；(4)将步骤(3)中得到的材料在去除植物激素的改良MSB5培养基上再生培养8-12周；(5)将步骤(4)所得到的材料转移到生根培养基上诱导生根，然后移栽至田间，或将步骤(4)得到的材料嫁接到具有1-2片真叶的棉苗上；(6)将步骤(5)得到的材料进行田间鉴定。
3.根据权利要求1或2所述的快速获得棉花转基因植株的培育方法，其特征在于，将10-50mg/L卡那霉素，或5U/L潮霉素加入到选择转化体培养基上，通过荧光显微镜观察转化体中GFP基因或GUS基因表达，快速鉴定转化体。
4.根据权利要求1或2所述的一种获得棉花转基因植株的培育方法，其特征在于，将转基因苗转移到加有0.1mg/L IAA，0.1mg/L，，kinetin，0.1mg/L赤霉酸(GA3)的Hsu生根培养基上培养，生根后的小苗再转移到灭菌的花房土中栽培。
5.根据权利要求1或2所述的一种获得棉花转基因植株的培育方法，其特征在于，将组织培养所获得的材料通过嫁接到1-2片真叶的棉苗上并转移到田间栽培。
全文摘要
本发明属于植物转基因技术领域。其特点是，在添加有维生素B1、B6、烟酸和植物生长激素的改良MSB5培养基上，将无菌棉花下胚轴切段在所述的培养基上培养，通过直接诱导芽生成而不是通过诱导胚状体生成的途径，可以快速、大批量获得转基因棉花植株。通过荧光体视显微镜观察报告基因GFP或GUS基因表达与否，快速鉴定转化体。本发明转化效率达到60－70％，鉴定转基因植株的方法简单、易行。
文档编号A01H4/00GK1429480SQ01138378
公开日2003年7月16日 申请日期2001年12月31日 优先权日2001年12月31日
发明者杨业华, 王学奎 申请人:华中农业大学
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