144例耳聋患者常见遗传性耳聋基因检测

耳聋是影响人类身心健康和生活质量的疾病。2013年召开的世界卫生组织全球防聋合作中心会议暨中国听力论坛上报告显示，我国现有听力残疾者2 780万人，居各类残疾之首。其中，0～6岁听障儿童约13.7万，且每年以2.3万的数量递增[1-2]，其中至少一半的聋儿是由于遗传缺陷引起的，在致聋原因中遗传因素起主要作用[3]。减少耳聋的发生重在早期预防和干预，明确其遗传学病因是关键。随着耳聋基因芯片技术的不断发展完善，为临床上耳聋基因的大规模筛查提供了便利条件。在不同地区和不同人群中耳聋基因的突变频率、突变方式和热点突变有很大差异，为了解长治市特殊教育学校耳聋人群的常见分子遗传病因学特点，2014年1月对长治市特殊教育学校144名聋哑学生用耳聋基因芯片方法进行了GJB2、GJB3、SLC26A4和线粒体DNA 12S rRNA 4个基因9个位点的检测，为本地区大规模开展高危人群的耳聋基因筛查提供理论依据。

1.对象：长治市特殊教育学校144名聋哑学生，原籍均为长治市，均为汉族。男、女分别为43.7%(63/144)和56.3%(81/144)，男∶女为1∶1.29，年龄6～24岁，平均(15.1±4.0)岁。

2.基本资料调查：通过一对一访谈调查基本情况，内容如下。(1)一般情况。登记时间、姓名、性别、年龄、民族、籍贯、出生年月、居住地址和电话等。(2)耳聋的发病时间、发病原因、耳聋以前是否会说话、耳聋病情进展及伴随症状等。(3)个人史。头部外伤史、耳毒性药物服用史及环境噪声史等。(4)母亲妊娠期情况。传染病史、耳毒性药物应用史及生产情况。

3.标本采集及DNA提取：抽取耳聋患者肘静脉血5 ml，EDTA抗凝，运用德国chemagen全自动提取仪提取全血DNA，并用博奥核酸浓度测定仪进行DNA浓度的测定。

4.PCR扩增：PCR反应体系的配制按被测样品数目的2倍(两套管分别用来检测同一样品的不同位点组合)准备200 μl离心管，并在管上标记样品编号，两套管要一一对应。从试剂盒中取出PCR扩增引物混合物及PCR扩增试剂混合物使其自然解冻，振荡混匀，扩增引物混合物分别和PCR扩增试剂混合物充分混匀。20 μl的PCR反应体系包括PCR扩增试剂引物混合物A 17 μl，模板DNA 3.0 μl；PCR扩增试剂引物混合物B 17 μl，模板DNA 3.0 μl。PCR扩增程序，见表1。

表1　PCR扩增程序

温度(℃)37959694降温速率55升温速率70604时间(s)600900603004℃/s3002℃/s45600⁃循环数(n)111321⁃

注：以0.5 ℃/s的速度从94 ℃降温至55 ℃；以0.2 ℃/s的速度从55 ℃升温至70 ℃

5.芯片杂交：杂交反应混合物的配制从试剂盒中取出杂交缓冲液，60℃加热使其完全融化。充分混匀后，在微量离心机中高速点动离心，按每份10 μ1分装。从同一个样品模板两个不同的扩增体系A、B管中各取2.5 μl PCR产物加入到对应的10 μ1杂交缓冲液管中，充分混匀并瞬时离心。将杂交反应混合物经盖片上的加样孔垂直加入14 μ1杂交混合物，迅速盖上杂交盒盖并密封。将密封好的杂交盒水平放入60 ℃预热的杂交仪中杂交60 min。杂交反应结束后，将杂交盒水平取出拆开，将芯片取出，放入芯片洗涤机中按程序进行洗涤，洗涤完成后放入芯片甩干机中离心3～5 min。使用晶芯LuxScanTM10K-B微阵列芯片扫描仪进行芯片扫描，使用晶芯遗传性耳聋基因检测芯片判别系统进行信号的读取及判断(图1)。

图1　信号的读取及判断　QC为表面化学质控探针；PC为杂交阳性对照探针；IC为基因扩增内对照探针；BC为空白对照探针；NC为阴性对照探针注：若在同个位点中W行检测数据为阳性，同时M行为阴性，判读结果为该位点野生型；若在同个位点中W行检测数据为阳性，同时M行为阳性，判读结果为该位点突变杂合型；若在同个位点中W行检测数据为阴性，同时M行为阳性，判读结果为该位点突变纯合型

6.质量控制　DNA提取、PCR扩增、杂交过程的所有试剂及器皿均进行严格的消毒。对无法判断结果的样品进行重复实验，并随机抽取5%样品进行重复实验。

7.统计学处理：采用SPSS 13.0软件进行统计学处理，率的比较采用χ2检验，检验水准α=0.05。

1.144例耳聋患者耳聋基因检测结果：144例耳聋基因检出异常者37例，检出率为25.7%，其中GJB2基因突变检出率为13.2%(19/144)，SLC26A4基因突变检出率为12.5%(18/144)；野生型基因检出率为74.3%(107/144)。

2.GJB2基因突变结果：299 del AT杂合、235de1C杂合、235de1C纯合、35 del G和235de1C复合杂合、176_191del 16和235 del C复合杂合、235 del C和299 del AT复合杂合突变检出率为0.7%(1/144)、4.2%(6/144)、4.2%(6/144)、0.7%(1/144)、0.7%(1/144)、2.8%(4/144)；总确诊率(单位点纯合突变及多位点杂合突变)为8.3%(12/144)，携带GJB2基因单等位基因突变的患者占9.0%(13/144)；携带GJB2基因双等位基因突变的患者4.2%(6/144)。

3.SLC26A4基因突变结果：IVS7-2 A > G杂合、2168 A >G 杂合、IVS7-2 A > G 纯合、IVS7-2 A > G 和2168 A >G复合杂合突变检出率为4.9%(7/144)、1.4%(2/144)、3.5%(5/144)、2.8%(4/144)；总确诊率为6.3%(9/144)，携带SLC26A4基因单等位基因突变的患者占6.3%(9/144)；携带SLC26A4基因双等位基因突变的患者占6.3%(9/144)。

4.基因型异常者性别分布：男和女异常耳聋基因异常检出率比较，差异无统计学意义，见表2。

表2　基因型异常者男女分布比较(例)

性别检测基因异常者检测基因正常者合计男135063女245781合计37107144

注：P=0.220

重度感音神经性耳聋中约50%为与遗传有关的非综合征性耳聋。本研究验证了长治特殊教育学校耳聋患者的常见致聋相关基因，包括GJB2(35 del G，176_191del 16，235 del C，299 del AT)、SLC26A4 ( IVS7-2 A > G，2168 A >G)，是本地区极重度感音神经性聋患者的突变热点。但GJB3(538C>T)无1例被检出，其与高频听力损失密切相关，这种突变的稀缺可能与受检人群的选择标准有关。另外线粒体DNA 12S rRNA也未被检出，可能与受检人群的选择标准或者样本量较小有关。

非综合性耳聋与多种缝隙连接蛋白(connexin, Cx)突变密切相关，Cx26是一种由GJB2基因编码的缝隙连接蛋白，该基因定位于染色体的13q11-q12,有2个外显子，目前已被发现报道的突变方式多达220多种[4]。GJB2最常见的突变位点为35 del G、176_191del 16、235 del C、299 del AT，中国最常见的突变位点是235 del C[5-6]，GJB2基因的编码区235位碱基C纯合性缺失导致遗传密码发生移码突变，致使突变位点以下的遗传密码全部发生改变，进而造成其翻译氨基酸的框架结构自突变位点以下变异[6]。此突变的发生产生了无功能的缝隙连接蛋白从而降低了缝隙连接的通透性影响到通道的正常开闭，致使钾离子流入内淋巴液的循环时产生障碍，导致感音神经性耳聋的发生[6]。中国人民解放军第二炮兵总医院[7]的全国性耳聋分子病因学研究的数据表明，GJB2基因最为常见的突变类型是235 del C，其次是299 del AT,176_191del 16和35 del G。

SLC26A4基因是非综合征耳聋常见致聋基因之一，此基因的不同改变可导致常染色体隐形耳聋和Pendred综合征。两者的共同特点是前庭水管扩大(enlarged vestbular agueduet, EVA)或Mondini畸形，EVA这种畸形的耳聋在先天性聋中占5%～10%[8]，该基因突变致聋多发生在儿童时期，发病前常有颅内压增高的诱发因素，其耳聋程度达重度到极重度。IVS7-2 A > G 突变是SLC26A4基因突变的主要形式，突变的主要分子基础在重要的剪切部位，第7内含子距第8外显子起始2个碱基位置的A至G的置换，造成第8外显子转录和翻译过程异常而产生异常的Pendrin蛋白[9]。戴朴等[10]研究表明，在我国IVS7-2 A > G是SLC26A4基因主要的突变位点，71.9%的EVA患者中检测到该突变，2%的正常人携带此种突变。

本研究证实长治特殊教育学校耳聋患者耳聋基因突变热点为GJB2基因235 del C突变，SLC26A4基因IVS7-2 A > G突变为本地区第二常见突变热点。SLC26A4基因突变患者应避免各种外伤、感冒或耳毒性药物的使用，避免加重耳聋的诱因。携带235 del C杂合突变的GJB2基因严重提示非综合性耳聋发病的遗传易感性，大都携带GJB2基因非综合性耳聋患者的螺旋神经节细胞数量正常，适合人工耳蜗植入，且此类患者在耳蜗植入后，言语理解能力强，预后良好。因此，明确GJB2基因突变致聋的分子病因学对治疗和预后都有重要意义。

参考文献

1　刘学忠,欧阳小梅,Yan D,等.中国人群遗传性耳聋研究进展.中华耳科学杂志,2006,4:81-89.

2　陈焕玲.153例耳聋患者的耳聋基因芯片检测.吉林:吉林大学,2008.

3　王继,张铁松.遗传性耳聋的基因研究进展.医学综述,2013,2:442-444.

4　于飞,戴朴,韩东一.GJB2基因突变及语前遗传性非综合征性耳聋.国外医学耳鼻咽喉科学分册,2005,29:359-361.

5　戴朴,刘新,于飞,等.18个省市聋校学生非综合征性聋病分子流行病学研究-GJB2 235delC 和线粒体DNA12SrRNA A155G突变筛查报告.中华耳科学杂志,2006,4:1-5.

6　Hilgert N, Smith RJH, Van Gamp G. Forty-six genes causing non-syndromic hearing impairment:Which ones shoud be analyzed in DNA diagnostics Mutat Res,2009,681:189-196.

7　陈文霞,许政敏,杨晓林,等.非综合征型聋儿的GJB2基因改变55例分析研究.中国儿童保健杂志,2010,18:948-950.

8　EverettLA, GlaserB, Beck JC, et al. Pendred syndrome is caused by mutations in putative sulphate transporter gene(PDS). Nat Genet,1997,17:411.

9　戴朴,韩东一,曹菊阳,等.家族性大前庭水管患者的PDS基因型分析.临床耳鼻咽喉科杂志,2006,20:147-150.

10　戴朴,韩东一,冯勃,等.大前庭水管综合征的基因诊断和SLC26A4基因突变分析.中国耳鼻咽喉头颈外科杂志,2006,13:303-307.