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基于单细胞空间组学，发表在国际顶刊Science上的3篇有关两栖动物蝾螈大脑的研究，构建了首个蝾螈脑再生时空图谱，发现大脑中所有细胞类型都能够再生，包括脑区间的连接，并揭示了大脑细胞类型演化过程中的关键创新（首个蝾螈大脑时空图谱；蝾螈端脑细胞多样性和神经元再生；蝾螈大脑演化关键创新）。那么由共同四足动物祖先演化而来的爬行动物鬃狮蜥（Pogona vitticeps），其大脑细胞类型和脑区又是如何演化的，与哺乳动物脑区之间有什么区别？

来自德国马克斯-普朗克脑科学研究所的研究团队，在同期Science上发表了针对鬃狮蜥和小鼠大脑进化保守性的研究成果。在这项研究中，研究人员利用scRNA-seq构建了鬃狮蜥大脑的单细胞转录组图谱，并与小鼠大脑单细胞数据集进行计算整合，确认了爬行动物与哺乳动物在共同祖先的基础上，各自独立演化出自身的神经元与神经回路特征，这颠覆了哺乳动物大脑演化的一个核心观点，即哺乳动物由爬行类演化而来，其大脑以爬行类的基本特征为主。以下是文章的详细解读。

文章题目：Molecular Diversity and Evolution of Neuron Types in the Amniote Brain

发表时间：2022-09-02

发表期刊：Science

主要研究团队：德国马克斯-普朗克脑科学研究所、歌德大学生物科学学院、哥伦比亚大学等

影响因子：63.714

DOI：10.1126/science.abp8202

研究背景

早期的四足动物在3.2亿年前完成了从水生环境到陆地环境的过渡，随后出现羊膜动物，并在之后不久分化为蜥形纲（sauropsids）（未来的爬行动物和鸟类）和合弓纲（synapsids）（未来的哺乳动物）动物。由于共同的祖先，所有四足动物的大脑都具有相似的基础结构，这些结构由胚胎发育期间建立的脑区域（如大脑皮质、下皮质、丘脑、小脑等）及其远程连接模式所定义。然而，这种共同组织的变异是如何促进谱系和物种特异性适应的尚不清楚。因此，研究人员通过scRNA-seq方法研究蜥形纲的鬃狮蜥和小鼠不同脑区的神经元类型保守性。

研究样本

选择重约100~450 g任意性别的鬃狮蜥，在解剖镜下提取端脑、间脑、中脑和后脑用于scRNA-seq分析。

研究策略

在解剖镜下分离成年鬃狮蜥的端脑、间脑、中脑和后脑，构建大脑单细胞图谱。然后，将得到的单细胞测序数据进行质检、过滤、标准化及细胞聚类，筛选出神经元细胞数据。接下来，将鬃狮蜥神经元细胞按照大脑区域划分，与小鼠单细胞数据进行整合并注释。最后，分析两个物种间脑区神经元的保守性和关键基因家族的表达差异，并通过原位杂交验证分析结果。

研究成果

1.成年鬃狮蜥大脑的细胞图谱

研究人员对来自成年鬃狮蜥的端脑、间脑、中脑和后脑的285,483个细胞进行scRNA-seq分析，描述了成年鬃狮蜥的单细胞转录组图谱（图1）。聚类分析确定了神经元和非神经元细胞的类别（图1B），并根据标记基因的表达对细胞类型进行了注释（图1C）。其中，研究人员共鉴定了89,015个神经元，分为了233个不同的细胞簇（图1D）。

图1 鬃狮蜥大脑的单细胞转录组图谱

研究人员对鬃狮蜥神经元细胞中关键基因家族表达进行分析，发现某些基因家族，如G蛋白偶联受体（G protein–coupledreceptors，GPCRs）和转录因子（特别是同源结构域型）表现出细胞类型特异性表达（图1E）。这支持了同源结构域转录因子在脊椎动物和无脊椎动物中作为神经元身份选择器的假说。因为转录因子，包括同源结构域转录因子，对脊椎动物神经系统的早期区域化至关重要。因此，研究人员根据数据集中表达的386个转录因子的表达情况，对聚类转录组进行了分层聚类分析。结果显示，该分类法能同时实现按照大脑区域和神经递质类型对神经元簇进行分组（图1F）。表明大脑区域和其中的单个细胞核可以通过一组转录因子的组合表达来识别。例如，端脑谷氨酸能神经元可以通过foxg1和zbtb18的共表达来区分。

2.转录组比较揭示神经元类型的跨物种保守性

为了详细研究物种间神经元类型的保守性和异质性，研究人员将鬃狮蜥的数据与已发表的小鼠全脑单细胞数据集（70,968个神经元，181个细胞簇）进行整合。通过标准化、聚类分析，研究人员将整合的单细胞数据分为32个聚类，其中20个细胞簇包括两个物种的神经元（即细胞簇中每个物种的细胞占比大于10%），部分仅包含单个物种神经元的细胞簇可能来源于取样差异。这说明两个物种间的神经元细胞具有一定的保守性（图2A）。进一步分析发现，保守细胞簇中的大多数神经元来自相同的大脑分区，因此研究人员将这些细胞簇划分到其对应的脑区。例如，簇11、簇16、簇17分别可归类到外侧、内侧和尾侧神经节隆起的GABA能神经元；簇24和簇9分别可归类为小脑抑制性神经元和颗粒细胞。

接下来，研究人员对两个物种间保守的整合簇进行差异基因分析，并对这些标记基因进行GO分析，发现这些基因主要定位在转录因子、神经元连接（细胞连接、突触信号传导、神经元投射、突触传递）和神经元发育的通路上。为分析转录因子表达模式在两个物种间的保守性，研究人员选择了tcf7l2（高迁移率蛋白家族）、mef2c（肌细胞增进因子2家族）、zic1（C2H2锌指蛋白家族）、tbr1（T-box脑蛋白家族）等具有代表性的转录因子，进行原位杂交（图2B），发现这些转录因子仅在特定的脑结构中表达。

综上所述，鬃狮蜥和小鼠大脑共有的转录因子和效应基因集不仅可用于识别保守的基因表达区域，而且可用于识别两个物种共有的神经元类型。

图2 鬃狮蜥与小鼠大脑单细胞数据的整合分析

3.蜥蜴和小鼠脑区神经元细胞亚类的保守性和异质性

小鼠和鬃狮蜥单细胞转录组的整合已识别出两个物种间大类神经元的保守性，但仍然无法确定单个神经元细胞聚类簇的保守性。因此，研究人员以小鼠的181个神经元细胞簇为参考，将233个鬃狮蜥神经元细胞簇与其比较，并将每个鬃狮蜥细胞簇中投射到小鼠细胞簇上的神经元数量定义为“投影分数”（projection scores），以反映细胞簇间的相似性（图3A）。在181个小鼠细胞簇中，研究人员发现有154个存在鬃狮蜥神经元细胞的投影，但这些细胞簇间的投影分数分布广泛；小鼠和鬃狮蜥之间保守性最高的神经元亚类包括屏状核和缰核中的神经元、纹状体中型多棘神经元、小脑颗粒细胞、中间神经元和浦肯野细胞（图3A），这与神经解剖学和标记基因表达模式分析的结果相同。同时，还发现了一些先前未发现的保守神经元亚类。例如，某些皮质GABA能中间神经元、丘脑内侧的谷氨酸能神经元，以及来自小鼠网状丘脑核的神经元。随后，研究人员通过原位杂交证实了这些神经元亚类的脑区定位。

图3 鬃狮蜥与小鼠大脑神经元细胞亚类的保守性和异质性

为了评估主要大脑分区（端脑、间脑、中脑和后脑）之间转录相似的神经元类型的数量是否具有显著差异，研究人员分析了每个分区的鬃狮蜥和小鼠神经元细胞簇之前的保守性（图3B），发现所有主要的大脑分区（小脑除外）都包含高分和低分的细胞簇，表明它们包含了分子上相似和不同的细胞类型。从蜥蜴和小鼠中选择3对每个投射得分较高的细胞类型对，并检测它们之间基因表达的相似性和差异性，研究人员鉴定了共有的标记基因和小鼠或蜥蜴的特异性标记基因（图3D）。

总之，蜥蜴和小鼠之间具有相当多转录组重叠的神经元类型，但也表现出特定的种间差异。

4. 蜥蜴和小鼠共有的转录因子组合分析

为了证实之前的发现并比较鬃狮蜥与小鼠的大脑神经元，研究人员选择了四个scRNA-seq数据集（端脑GABA能中间神经元、丘脑、下丘脑和上丘脑）进行整合和聚类分析，发现鬃狮蜥与小鼠的神经元能够很好地整合在一起（图4）。例如，在端脑GABA能中间神经元中，识别出保守的亚类包括内侧神经节隆起或尾神经节隆起的神经元（图4A）；在下丘脑中，保守的亚类包括来自腹内侧下丘脑、室旁核、弓等神经元关节簇（图4B）；在上丘脑中，保守的亚类包括上丘脑和视质结构浅层中的GABA能中间神经元等（图4C）；在丘脑中，保守的亚类包括小鼠网状丘脑核、鬃狮蜥腹内侧丘脑核神经元等（图4D）。

接下来，研究人员分析了这些相似性背后的分子特征。在物种特异性数据集上鉴定了差异表达的基因，并以组合特异性的方式进行跨物种比较，以确定物种间保守的标记基因。然后，研究人员选择转录因子来分析整合簇是否可以由转录因子的表达模式来定义，发现进化上保守的神经元类别可以通过表达一组核心转录因子来定义（图4E~H）。

图4 鬃狮蜥与小鼠大脑保守神经元的表达模式

5. 爬行动物和哺乳动物丘脑的部分分化

丘脑是位于感觉-运动外围和大脑皮层之间的关键脑区域。由于爬行动物大脑皮层保留了祖先的特征，分析爬行动物丘脑的分子模式可以帮助我们了解大脑区域间连接与脑区共同进化之间的关系。而哺乳动物新皮层的生长和复杂化反映在丘脑的匹配生长和复杂化上，因此研究人员在蜥蜴和小鼠中探究丘脑神经元类型之间的分子差异。

图5 爬行动物和哺乳动物丘脑的部分分子和解剖差异

研究人员通过解剖区域和基因表达分析鬃狮蜥丘脑中的7,721个神经元，识别出4,244个是谷氨酸能神经元，2,617个是GABA能神经元（图5A）。这些单个神经元可分为37个簇，并通过标记基因的特定组合进行注释。研究人员对鬃狮蜥丘脑谷氨酸能神经元的转录组进行主成分（PCA）分析，将其分为了两类，即背侧（DMT1至DMT4）和外侧丘脑神经元（图5C、5D）。在小鼠丘脑谷氨酸能的RNA-seq研究中也报道了类似的发现，并通过与小鼠丘脑scRNA-seq数据的整合分析得到证实。两物种间的联合分析表明，背侧丘脑神经元具有较强的保守性，而外侧丘脑神经元在两物种间具有较强的异质性（图5E）。

分析数据表明，来自蜥蜴丘脑腹内侧核的神经元形成了四个可分离的转录组簇，并且它们与小鼠RTn一起聚集（图5F）。在这两个物种中，这些神经元类型具有相似的转录因子表达谱（表达six3、meis2、isl1，不表达pax6），并共有离子通道基因cacna1i、kcnip1及其他等效基因（图5G）。因此，可以认为鬃狮蜥腹内侧丘脑核是哺乳动物RTn的同系物。

结论

利用scRNA-seq，研究人员在鬃狮蜥和小鼠的大脑中发现了一组具有高度转录组相似性的核心神经元类型。这些保守的神经元类型分布于所有脑区，包括大脑皮层，这挑战了大脑某些区域比其他区域更古老的观念。研究数据表明，即使大脑由古老的和共有的分子决定因素定义的发育模块组成，大脑的进化也会通过不同脑区的保守或异质的神经元之间的相互作用决定，这种方式可能与脑区的局部和远程连接相关。

本研究通过蜥形纲（鬃狮蜥）和合弓纲（小鼠）动物大脑单细胞数据的整合比较分析，确定了两物种间神经元类型的保守性及其对应的分子表达模式，为脊椎动物大脑的进化研究提供了新的证据。同时，对丘脑的研究发现了脊椎动物脑区连接与其协同进化的关系。