阿司匹林酯酶活性及其与阿司匹林抗凝血作用的相关性研究

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作者：

王建筑

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摘要：

目的:阿司匹林问世已有一百余年.上世纪70年代发现,阿司匹林可以通过不可逆的抑制环氧化酶-1(COX-1)的活性,从而发挥抗血小板聚集的作用.但是,在长期随访中发现,应用阿司匹林治疗的相当一部分患者在服用阿司匹林后并不能充分地抑制血小板聚集,因此,近年来提出阿司匹林抵抗(aspirin resistance,AR)的概念.阿司匹林在吸收过程中和吸收后会迅速的被存在于血浆,肝脏及胃粘膜中的阿司匹林酯酶水解为水杨酸,而在体内发挥抗血小板聚集作用的是阿司匹林的原型药物,被阿司匹林酯酶水解为水杨酸后失去此作用,因此服用阿司匹林后,在体内是否发挥抑制血小板聚集作用,作用强弱以及阿司匹林抵抗现象都可能与人体内阿司匹林酯酶活性相关.本研究的目的是证实这一相关性,探讨阿司匹林酯酶活性是否是影响阿司匹林抗凝疗效及导致阿司匹林抵抗的原因之一,来指导阿司匹林临床个体合理化给药.本课题建立同时测定血浆中阿司匹林和水杨酸浓度的高效液相色谱法,采用阿司匹林(ASA)与水杨酸(SA)比值SA/(ASA+SA)表示血浆阿司匹林酯酶的活性,并对阿司匹林酯酶体外培养条件进行优化,测定血浆阿司匹林酯酶活性可以为临床合理用药提供了科学依据.采用健康中国人的血浆为阿司匹林酯酶的酶源来研究该酯酶的动力学特性.测定100例健康中国人血浆中阿司匹林酯酶的活性,考察阿司匹林酯酶活性在中国人群中的分布情况.考察临床上经常与阿司匹林联合应用的药物对阿司匹林酯酶的影响,为临床合理化用药提供依据.由于阿司匹林酯酶在人体的肝脏,红细胞及胃粘膜中也有分布,但目前尚没有反映全身阿司匹林酯酶活性的指标,因此我们建立阿司匹林酯酶的体内活性指标,研究阿司匹林酯酶活性与阿司匹林抗凝血疗效的相关性,考察阿司匹林酯酶活性高低,即阿司匹林体内的水解速度是否是影响阿司匹林抗凝血疗效及导致阿司匹林抵抗的原因之一. 方法:实验采用Phenomenex C_(18)柱(4.6mm×150mm,5μm);岛津Shim-pack C_(18)预柱(4.6mm×10mm,5μm);流动相为乙腈-0.072mmol·L~(-1)磷酸(22:78,v/v);检测波长为228 nm;流速:1.0 mL·min~(-1);柱温:30℃:进样量20μL,建立了同时测定血浆中阿司匹林和水杨酸的浓度的方法.以阿司匹林与水杨酸的比值SA/(ASA+SA)表示阿司匹林酯酶的活性,并用正交试验设计分析法对其体外培养条件进行优化选择;通过选择不同的条件,对该酯酶的酶动力学特性进行研究;利用建立的阿司匹林酯酶活性的测定方法,测定100名健康中国人血浆中的阿司匹林酯酶活性,绘制概率分布直方图,观察该酯酶在中国人群中的分布;在培养体系中不加入和加入临床上经常与阿司匹林合并应用的其它药物(化合物),测定阿司匹林酯酶的活性变化,考察临床上联合用药对阿司匹林酯酶的影响.通过利用气相色谱-质谱联用方法测定12例健康志愿者口服100mg拜阿斯匹灵后的血浆清除率,来考察某一特定时间点血浆SA/ASA比率与阿司匹林清除率的相关性,来确定阿司匹林酯酶体内活性指标,并通过考察阿司匹林酯酶活性与临床阿司匹林疗效指标(TXB_2,6-keto-PGF_(1α))之间的相关性,确定血浆阿司匹林酯酶活性高低是否是影响阿司匹林抗凝血疗效及产生阿司匹林抵抗的原因之一. 结果采用RP-HPLC法同时测定血浆中的阿司匹林和水杨酸的浓度,具有快捷有效的样品前处理,样品分析时间少,良好的分离度和可靠性的特点,并且可以克服提取及分析过程对测定的干扰,结果显示阿司匹林在0.08～5.121μg/mL范围内线性关系良好,水杨酸在0.05～4.00μg/mL范围内线性关系良好.利用正交试验设计分析法对体外培养条件优化选择得出的最佳的培养条件是A_2B_2C_3D_1,即以1mmol·L~(-1)阿司匹林,200μL血浆,在pn为7.6的培养液中培养20min.阿司匹林酯酶的米氏常数Km=429.67nmol·L~(-1)和Vmax=2.56μmol·min~(-1)·mL~(-1)(血浆),最适反应温度为37℃,培养缓冲液最适pH为7.4,该酶对pH的变化较敏感,对热极不稳定.临床上经常与阿司匹林合用的药物中,硝苯地平,地尔硫卓,维拉帕米,双嘧达莫,卡托普利,美托洛尔,非那西汀,扑热息痛,川芎嗪等药物对阿司匹林酯酶活性具有较显著的抑制作用;而苯巴比妥,卡马西平,丙戊酸,丹参素钠,利多卡因等这些药物对阿司匹林酯酶具有较显著的诱导作用;辛伐他汀,氢氯噻嗪,咖啡因这些药物对阿司匹林酯酶的影响不明显.100名健康受试者的阿司匹林酯酶活性平均值为(0.2167±0.0683);67名健康男性和33名健康女性的阿司匹林酯酶活性分别为(0.2159±0.0692)和(0.2173±0.0684),两者之间无显著性统计学差异(P>0.05).口服阿司匹林后,经过对血浆清除率和各个时间点的水杨酸(SA)和阿司匹林(ASA)的比值的进行相关性分析后发现,3.5小时的血浆中的水杨酸和阿司匹林的比值与阿司匹林的口服清除率显著相关性最好(r=0.882,P