一种黑腹果蝇GMR>Snail细胞死亡模型的建立方法与流程

本发明属于生物遗传学技术领域，具体涉及一种黑腹果蝇gmr;snail细胞死亡模型的建立方法。

背景技术：

果蝇遗传学操作系统，有gal4/uas双表达系统。gal4/uas双表达系统：gal4/uas系统是果蝇中最为常用的转基因技术体系，可以让外源基因或rnai在特定细胞或组织选择性表达。半乳糖调节上游启动子元件（galactose-regulatedupstreampromoterelement4），缩写gal4，是酵母中类似于原核生物乳糖操纵子的一个转录激活子。上游激活序列uas（upstreamactivatesequense），是酵母中另一种类似高等真核生物增强子的序列。gal4通过与uas相结合，调节与半乳糖代谢相关基因的表达。1993年，科学家将目的基因x连接在uas之后，通过转基因技术建立uas-x果蝇品系，然后与特定的gal4果蝇品系杂交，在后代中就可以得到同时具有y-gal4和uas-x的果蝇，从而实现特异性的在y组织表达x基因（参考文献1，branda.h.andperrimonn.,targetedgeneexpressionasameansofalteringcellfatesandgeneratingdominantphenotypes.development,1993,118:401-15）。因为果蝇基因组不编码gal4转录因子，所以在果蝇体内过量表达gal4，不会对果蝇的发育产生显著的影响。同样，在果蝇体内插入uas调控序列，也不会对果蝇产生影响。这个系统的建立为利用果蝇作为研究模型的科学家在实验设计上提供了有利、便捷、高效的遗传操作工具。gal4/uas双表达系统示意图如图1所示。

果蝇作为研究人类疾病的模式生物,与哺乳动物不仅在基本的生物学、生理学和神经系统机能等方面比较相似,而且果蝇有其作为模式生物的独特优势。近年来的研究表明,果蝇和人类在肿瘤发生信号通路等方面的保守性很高,而且果蝇具有很强的遗传学可操作性,是肿瘤学研究有效的模型之一,可用于研究人类肿瘤发生、发展、转移等分子机制。近年来研究人员已经建立了很多用于研究特定的果蝇模型，但是新的特定的果蝇模型的建立对阐明疾病发生的分子机制起到重要作用，将会为更多疾病的临床治疗提供新的药物靶点和治疗方案。因此，建立新的特定的果蝇模型是本领域技术人员亟待解决的技术问题。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供一种黑腹果蝇gmr;snail细胞死亡模型的建立方法及其应用。

本发明的另一目的在于提供上述方法建立的黑腹果蝇gmr;snail细胞死亡模型。

本发明的目的可以通过以下技术方案实现：

一种黑腹果蝇gmr;snail细胞死亡模型的建立方法，采用特定的果蝇品系进行杂交后培养并筛选获得黑腹果蝇gmr;snail细胞死亡模型，具体包括以下步骤：

（1）将基因型为+;gmr-gal4w/sm6b-tm6b.tb的gmr-gal4果蝇品系与基因型为w1118;uas-snail74b的uas-snail74b果蝇品系进行杂交，选择正常，非短粗、红色小眼的后代基因型为uas-snail74b/+;gmr-gal4w/+的果蝇，即为gmr;snail细胞死亡模型；

（2）为了进一步传代和保存该模型，将得到的基因型为uas-snail74b/+;gmr-gal4w/+的雌性果蝇与基因型为sp;sb/sm6b-tm6b.tb的雄性果蝇品系进行杂交，引入平衡子，在后代中选择小眼、卷翅、短粗，基因型为uas-snail74b;gmr-gal4w/sm6b-tm6b.tb的果蝇，建立细胞死亡模型的保存品系。

步骤（1）中所述的gmr-gal4果蝇品系与uas-snail74b果蝇品系进行杂交时亲本雌雄任意组合均可。

所述培养过程中所用的培养基的配方为红糖135g，琼脂7g，玉米粉85g，酵母8g，丙酸4ml和水1000ml。

所述培养的条件为：温度20~30℃恒温，湿度50%-60%；优选为温度25℃恒温，湿度50%-60%。

步骤（1）和步骤（2）将不同果蝇品系进行杂交的过程为：将果蝇麻醉后，在通有co2的平板上进行挑选雌雄、杂交和观察表型的操作；做杂交实验前必需收集未交配过的处女蝇；所述处女蝇选取方法为将原种瓶中的成虫全部清除，此后每隔8小时收集刚羽化的雌果蝇即为处女蝇。

上述的方法在构建黑腹果蝇gmr;snail细胞死亡模型中的应用。

上述方法构建的黑腹果蝇gmr;snail细胞死亡模型。

本发明的有益效果：

本发明所构建的黑腹果蝇gmr;snail细胞死亡模型，可以用于涵盖果蝇全基因组的rna干扰（rnai）品系库的大规模遗传筛选，以期寻找介导snail诱导的细胞死亡的全新调控因子。这有助于研究者进一步了解发育过程中不同细胞因子或信号通路的相互作用，构建和完善调控细胞死亡的信号转导网络，为癌症等疾病的防治提供新的药物靶点和治疗方案。

附图说明

图1为gal4/uas双表达系统示意图。

图2为果蝇雌雄辨别示意图。

图3为果蝇杂交流程示意图。

图4为上调snail的表达可以诱导果蝇眼睛发育过程的细胞凋亡。

其中，图a，图b为通过acridineorange(ao)染色检测到大量的细胞死亡；图c为图a，b中ao染色标记的细胞死亡数量的统计图；图d，图e为在果蝇成体中观察到细胞死亡导致的小眼表型；图f，g为小眼表型可以被表达两个不同来源的snail的rna干扰（rnai，下调snail）几乎完全抑制，说明这一细胞死亡的眼睛表型确实是由过表达snail引起的。

图5dfoxo调控了snail诱导的细胞死亡。

其中，图a为单独gmr-gal4的成虫果蝇眼睛，此处作为正常组的对照；图b为gmr-gal4驱动uas-snail过表达的成虫果蝇眼睛，即gmr;snail的小眼模型；图c，d为gmr;snail的细胞死亡小眼模型可以分别表达dfoxo的rnai或移除一份内源性的dfoxo明显抑制，说明dfoxo参与调控了snail诱导的细胞死亡。

具体实施方式

实施例1建立黑腹果蝇gmr;snail细胞死亡模型

一、果蝇的饲养及实验条件

（一）果蝇培养基的配制

实验用的果蝇品系及杂交实验均将果蝇饲养于标准的红糖-玉米粉-酵母培养基上，其中培养基的配方如下：红糖135g，琼脂7g，玉米粉85g，酵母8g，丙酸4ml和水1000ml。

配制过程：（1）将称量好的红糖和琼脂一起倒入电饭锅中，加入适量水，充分搅拌；（2）加热至沸腾；（3）将已用水充分溶解好的玉米粉缓慢倒入锅中，持续搅拌；（4）加热至沸腾；（5）待混合物冷却至80℃左右，加入提前用温水溶解好的酵母，充分搅拌；（6）加入适量丙酸溶液，充分搅拌；（7）将培养基分装于灭菌的玻璃管中；（8）塞上棉花后，置于阴凉处存放。

（二）实验条件

温度25℃恒温，湿度50%-60%，一般饲养于25℃恒温恒湿的培养箱或果蝇房中。

（三）果蝇雌雄的鉴别

（1）体型：雌果蝇体型较大，雄的较小。（2）腹部末端：雌果蝇腹部椭圆末端稍尖，雄果蝇末端钝圆。（3）腹部背面：雌果蝇有明显5条黑色条纹，雄果蝇的有3条，前2条细，后1条宽，至腹面，肉眼可见腹部末端有一明显黑点。（4）腹部腹面：雌果蝇有较明显的6个腹片，雄果蝇有4个腹片。（5）性梳：雄果蝇第一节足底侧最上部附足前端表面有黑色鬃毛－性梳。（6）交尾器：判断雌雄果蝇的最主要的区别。果蝇雌雄辨别示意图如图2所示。

（四）果蝇的麻醉及杂交

果蝇的麻醉方法是二氧化碳(co2)气体麻醉法。用作杂交实验的亲本果蝇，不能过度麻醉，否则会影响果蝇的生活力。果蝇的麻醉状态和麻醉后死亡的区别以翅膀是否外展为依据。麻醉状态的果蝇两个翅膀仍然重叠在背腹上，而死亡的果蝇翅膀离开腹部呈外展状态。

将果蝇置于通有co2的平板上，3-5秒可将果蝇麻醉。待果蝇麻醉后，依照雌果蝇和雄果蝇外观表型的不同，分别收集未交配的雌性处女蝇和健康的雄性果蝇，按照杂交实验流程，将杂交需要的亲本（雌蝇和雄蝇）进行组合后，置于同一果蝇管内（已添加新鲜的培养基）饲养，收集后代，并观察杂交目标后代的表型。

由于雌果蝇生殖器官中有储精囊，一次交配后可储存大量精子，供多次排卵受精用，因此做杂交实验前必需收集未交配过的处女蝇，否则实验结果是不可靠的。选取方法：将原种瓶中的成虫全部清除，此后每隔8小时收集刚羽化的雌果蝇，放入培养瓶中备用。由于刚羽化的果蝇，其身体细长而幼嫩得几乎透明，从腹部的腹面透过几丁质的外壳，可以看到腹腔内的黑色消化道。因此，可观察到黑色消化道的雌性个体即为处女蝇。

二、黑腹果蝇gmr;snail细胞死亡模型的建立

1、建立模型所需果蝇品系

1）gmr-gal4，位于果蝇第三号染色体上，该品系果蝇眼睛为红色，不能纯合，具体基因型为：+;gmr-gal4w/sm6b-tm6b.tb，订购于中科院上海生科院生化与细胞所果蝇资源与技术平台。

2）uas-snail74b，为野生型snail，位于果蝇第二号染色体上，该品系果蝇眼睛为黄色，可以纯合，具体基因型为：w1118;uas-snail74b，订购于中科院上海生科院生化与细胞所果蝇资源与技术平台。

3）uas-snail-irv，位于果蝇第三号染色体上，可以纯合，订购于viennadrosophilarnaicenter，编号：v6232。

4）uas-snail-irb，位于果蝇第三号染色体上，可以纯合，订购于美国indiana大学的bloomingtondrosophilastockcenter，编号：bl28679。

5）w1118,位于果蝇x染色体上，订购于清华大学果蝇中心，编号：thj0265。

6）sp;sb/sm6b-tm6b.tb，果蝇二号三号染色体相连接的工具果蝇，订购于中科院上海生科院生化与细胞所果蝇资源与技术平台。

2、结果基因型如下

图4a：gmr-gal4w/+

图4b：uas-snail74b/+;gmr-gal4w/+

图4d：gmr-gal4w/+

图4e：uas-snail74b/+;gmr-gal4w/+

图4f：uas-snail74b/+;gmr-gal4w/uas-snail-irv

图4g：uas-snail74b/+;gmr-gal4w/uas-snail-irb

3、实验方法

（1）将收集好的雌性处女蝇和健康雄性果蝇按照杂交流程进行杂交，果蝇杂交流程见图3，详细步骤如下：

a.模型建立

选取基因型为+;gmr-gal4w/sm6b-tm6b.tb的gmr-gal4果蝇品系，分别于w1118和uas-snail74b（基因型为w1118;uas-snail74b）的果蝇品系进行杂交，此杂交的亲本雌雄可互换；其中w1118组为对照组，uas-snail74b组为模型组，杂交的培养基中可添加适量酵母颗粒，有利于雌果蝇大量产卵，以便收集后代；杂交应温度25℃恒温，湿度50%-60%的培养箱中；对照组中，选取体型正常（非卷翅，非短粗）、红色大眼的杂交后代（基因型为：gmr-gal4w/+）为对照，模型组中，选取体型正常、红色小眼的杂交后代（基因型为：uas-snail74b/+;gmr-gal4w/+），即为gmr;snail细胞死亡模型。

b.模型保存

由于在基因型为uas-snail74b/+;gmr-gal4w/+的果蝇后代中，配对的染色体之间会发生同源染色体重组，导致我们所得到的细胞死亡模型不能传代保存。为了解决这一问题，我们使用工具果蝇sp;sb/sm6b-tm6b.tb品系，引入平衡子（balancer），避免同源染色体重组的发生。具体操作方法：将基因型为uas-snail74b/+;gmr-gal4w/+的雌性处女蝇与sp;sb/sm6b-tm6b.tb品系的雄性果蝇进行杂交，在杂交后代中选取小眼、卷翅、身体短粗的果蝇，即得到了基因型为uas-snail74b;gmr-gal4w/sm6b-tm6b.tb的模型保存品系。

c.模型验证

为了进一步验证我们得到的uas-snail74b;gmr-gal4w/sm6b-tm6b.tb的细胞死亡模型保存品系确实是因为snail蛋白的过量表达激发的，我们在gmr;snail的细胞死亡小眼模型的基础上通过表达snail的rnai下调snail，发现小眼表型确实被抑制，进一步验证了我们建立的模型。具体操作方法：基因型为uas-snail74b;gmr-gal4w/sm6b-tm6b.tb的模型保存品系分别于两个snail的rnai品系进行杂交，在后代选取体型正常、非短粗的果蝇，基因型分别为：uas-snail74b/+;gmr-gal4w/uas-snail-irv和uas-snail74b/+;gmr-gal4w/uas-snail-irb，将得到的目标果蝇的眼睛与基因型为uas-snail74b/+;gmr-gal4w/+的眼睛进行对比，观察果蝇眼睛大小有无改变。

（2）收集杂交后代的目标果蝇，置于-20℃冷冻处死，对成虫果蝇眼睛的拍照，用于拍照的体式显微镜为日本olympus-bx51显微镜。

（3）收集杂交后代的目标果蝇，对其三龄幼虫期的眼成虫盘（eyediscs）进行解剖，固定剂固定后用于ao染色，并拍照解剖。

（4）ao染色：吖啶橙(acridineorange，ao)是一种荧光染料，它能够嵌入到单链的dna或者rna上并发出荧光。凋亡或死的细胞中dna会发生断裂，使ao能够嵌入到核中的dna上，因此ao染色被应用于检测细胞死亡（参考文献2，abramsj.m.,whitek.,fesslerl.i.,etal.,programmedcelldeathduringdrosophilaembryogenesis.development,1993,117:29-43）。

ao试剂配制：将ao粉末溶解于灭菌的ddh2o水中，配置浓度1×10-3m，作为母液，保存于4℃。

果蝇眼成虫盘ao染色步骤如下：

（1）将解剖好的组织加入到含有1×10-6mao的1×pbs溶液中；

（2）室温避光染色5分钟；

（3）用pbs漂洗3次；

（4）光学显微镜下，在载玻片上迅速解剖分离出所需组织；

（5）制片并用荧光显微镜，选择相应通道进行拍照并保存。

4模型简介

利用gmr-gal4在黑腹果蝇眼部特异性地过表达转录因子snail（uas-snail74b），可以在三龄幼虫期眼成虫盘形态发生沟(morphogeneticfurrow，mf)后部区域中，通过acridineorange(ao)染色检测到大量的细胞死亡(图4a，b)，图4c为图4a，b中ao染色标记的细胞死亡数量的统计图。

同时我们可以在果蝇成体中观察到细胞死亡导致的小眼表型（图4d，e），且这一小眼表型可以被表达两个不同来源的snail的rnai（下调snail）几乎完全抑制（图4f，g），说明这一细胞死亡的眼睛表型确实是由过表达snail引起的。gmr;snail细胞死亡模型因此成功建立。如图4为上调snail的表达可以诱导果蝇眼睛发育过程的细胞凋亡。

gmr;snail细胞死亡模型，可以用于涵盖果蝇全基因组的rna干扰（rnai）品系库的大规模遗传筛选，以期寻找介导snail诱导的细胞死亡的全新调控因子。这有助于研究者进一步了解发育过程中不同细胞因子或信号通路的相互作用，构建和完善调控细胞死亡的信号转导网络，为癌症等疾病的防治提供新的药物靶点和治疗方案。例如：通过遗传筛选，我们发现gmr;snail的小眼表型可以被表达转录因子dfoxo的rnai或缺失一份内源性的dfoxo部分抑制（图5），说明dfoxo调控了snail诱导的细胞死亡。