实操技巧

刺激物的种类与质量直接关系到ELISpot结果的好坏。一方面，即使细胞状态再好，如果刺激物不能形成有效的刺激，那也不会出ELISpot斑点；另一方面，如果刺激物不纯，那么即使刺激出了斑点，也不见得是我们想要的斑点，反而会造成假阳性，得出错误的结论。

刺激物的溶解、稀释、保存和使用

刺激物的浓缩形式分为干粉和液体，液体分为水溶液和DMSO溶液。不论这些浓缩形式如何，使用前都需要溶解和稀释，建议用不含血清的RPMI-1640或者ELISpot专用无血清培养基溶解和稀释至10×终浓度储存液，使用时10μL/孔。如果加样体积过低，加液的准确性会成问题；如果加样体积过高，加入孔中会对细胞培养基有明显的稀释作用。

长期保存建议存放于-20°C或超低温冰箱；短期可以放在4°C冰箱。无论何种刺激物，在存放过程中应尽量避免反复冻融。

使用的时候，建议先在ELISpot孔中加入100μL的细胞悬液，随后小心悬空式加入10ul刺激物（液滴刚好触碰到孔内液面），注意枪头不要接触到底膜。刺激物通过自由扩散可以很快分布均匀，千万不要拍打或者反复吹吸，这样会使细胞分布不均匀。

刺激物分类

不同的化合物可用于刺激细胞分泌细胞因子。刺激物可以是单克隆抗体或肽、合成化合物或从细菌或植物中纯化的物质。使用抗原特异性肽刺激物和CD3单克隆抗体刺激物通常是优选的，因为成分是明确，不确定因素少。然而，这种类型的刺激可能不适用于所有物种，也不会诱导所有细胞因子。

1非特异性刺激物

非特异性的刺激物可以激活几乎所有淋巴细胞，并使其分泌各种细胞因子，还触发许多其它细胞行为，比如增殖等。这些非特异性的刺激物通常是有丝分裂原，比如植物凝血素（PHA），伴刀豆蛋白A（ConA），离子酶素/佛波酯（Ionomycin/PMA），细菌脂多糖（LPS），美洲商陆PWM等等。其中LPS刺激B细胞，PWM可刺激T和B两类细胞，PHA和ConA刺激T细胞。

通常情况下，用PHA刺激人或者猴子的淋巴细胞，用ConA刺激小鼠、大鼠的淋巴细胞，用细菌脂多糖（LPS）刺激小鼠的淋巴细胞，离子酶素/佛波酯需要联合起来使用，才能对各种属的淋巴细胞都有比较好的刺激作用。

PHA与ConA的化学本质是蛋白质，因此稳定性稍差一些，使用过程中要注意存放方式，避免反复冻融。市面上出售的PHA与ConA在纯度、质量上都参差不齐，用途也各不相同，建议购买细胞培养级别的冻干粉。这些干粉往往只标明了重量（毫克数），相同重量干粉，生物活性差别可达一两个数量级，所以需要在大范围内摸索一个合适的终浓度。

离子酶素/佛波酯（Ionomycin/PMA）的化学本质属于有机小分子，稳定性较好，较容易保存，最佳浓度很容易摸索，实验结果的稳定性也较好。需要注意的是最好将两种成分混合起来使用，单一成分的刺激效果非常有限。

2特异性刺激物

特异性刺激物通常包括三类：T细胞表位肽、重叠多肽库和蛋白质。

2.1 T细胞表位肽

T细胞表位肽是最好的特异性刺激物。由于每一条T细胞表位肽都有相对应的MHC分子，代表了一种特异性的细胞免疫，因此不确定因素少，实验结果非常明确。

也可以把很多条T细胞表位肽混合起来，形成混合T细胞表位肽库。它刺激的效果是单独每条表位肽刺激效果的叠加。国际上通用的标准阳性刺激物CEF就是这样一个混合T细胞表位肽库。CEF多肽库由32条多肽混合而成，分别取自于巨细胞病毒（Cytomegolovirus，CMV）、EB病毒（Epstein-Barr virus, EBV）和流感病毒（Influenza virus）。这32条多肽同时也都是人类T细胞表位肽，分别受HLA等位基因A1、A2、A0201、AA68、A3、A11、A6081、A24、B7、B8、B18、B27、B35、B44、B0702的限制。

由于健康人群也可能感染CMV、EBV或者流感病毒，也会产生特异性的细胞免疫。所以用CEF刺激健康人的PBMC也会出现特异性的ELISpot斑点。这正是国际上选用CEF做ELISpot阳性标准刺激物的原因。

T细胞表位肽虽好，但是使用限制很多，我们必须对抗原的T细胞表位有深入的研究和了解，这样才能去合成。另外，每一条T细胞都严格地受到相应的MHC基因型的限制，检测对象的基因型要匹配才可能会有反应。

2.2 重叠多肽库

正是由于T细胞表位肽在使用中有种种限制，所以人们采用了重叠多肽库策略。重叠多肽库策略属于数学上的穷举法：在不知道T细胞表位肽位置信息的情况下，也不知道检测对象MCH基因型，那我把所有可能的多肽都合成出来！

这种办法虽然繁琐，费用高，但是效果还不错。具体做法是，人工合成一系列的多肽（通常是15aa），覆盖蛋白序列的每一区间：Aa1-15、Aa2-16、Aa3-17……Aa (n-14)-n。可以看出来，重叠多肽库的合成量是很巨大的。比如一种蛋白序列200aa，那么该蛋白的重叠多肽库有186条多肽，需要合成2780个氨基酸！所需投入的费用也将是一个惊人的数目！

好在现在生物信息学有了长足发展，人们发展了十来种预测MHC结合肽——包括T细胞表位肽（CTL表位）、B细胞表位肽——的数学算法（Bhasin, M. et. al., 2004；Flower, D. R. et. al., 2002；Guan, P. et. al., 2003；Blythe, M. J. et. al., 2002；De Groot, A. S. et. al., 1999）。互联网上有好多提供付费或者免费预测T细胞表位肽的网站，比如http://bioinformatics.uams.edu/mirror/propred1/；http://www.syfpeithi.de/Scripts/MHCServer.dll/EpitopePrediction.htm等等。

虽然现在的预测最多只能达到大约70%的准确率（通常只有30%-50%），但毕竟已经大大减少了选择空间，可以大幅度提高合成重叠多肽库的命中率。所以，经过生物信息学帮助，重叠多肽库是未来ELISpot刺激物的主流选择。

注意：

重叠多肽（通常15aa）并不是T细胞表位肽(7-11aa)，而是比T细胞表位肽要长一些，它不能直接被APC呈递，而是像蛋白质一样需要完整的内化、加工过程。所以以此作为刺激物，孵育时间比用T细胞表位肽要长一些。

国内有数十家合成多肽的公司，合成质量参差不齐，一定要选择口碑好的公司，否则使用效果会大打折扣，甚至根本不出结果。公司合成多肽，是根据纯度收费的，原则上ELISpot刺激物的纯度越高越好，但是考虑到实际性价比，90%的纯度是比较合理的。

2.3 蛋白质

蛋白质作为ELISpot刺激物，优缺点参半。

优点：蛋白质包含了所有的T细胞表位肽信息，可以不必考虑MHC的基因型；相对廉价。

缺点：相比人工合成的多肽，蛋白质的纯度难以保证；如果是大肠杆菌表达的蛋白质，那么内毒素会是一个更严重的问题；需要APC全程加工处理，对细胞密度和孵育时间有特定的要求。

这里有必要把使用蛋白质作抗原的缺点说清楚。蛋白质做抗原的最大问题在于蛋白的纯度很难保证。所谓纯度有两层含义：其一，杂蛋白的影响。杂蛋白会有一些非特异性的刺激，并且造成实验孔的图像背景加深。其二，内毒素的影响。内毒素对哺乳动物T细胞的刺激非常强。只要有微量的内毒素残留，就会显著的刺激细胞，产生非特异性的斑点。如果内毒素含量超标，有可能内毒素的斑点盖过蛋白刺激产生的斑点。

所以建议最好选用哺乳动物细胞表达的蛋白，或者其次昆虫杆状病毒系统以及酵母系统表达的蛋白。如果只能选用大肠杆菌表达的蛋白，实验前一定要测定内毒素含量。内毒素测量是很常规的技术，通常采用鲎试剂。国产的鲎试剂也不错，花费也不大。每毫克蛋白的内毒素要控制到100EU以下才能获得较好的效果。

2.4 组织浸出液、提取物

最好不要用这类物质作为ELISpot刺激物，成分太杂太乱，出了结果也说不清楚。

2.5 其它刺激物

有的实验者直接用成品疫苗作为刺激物。由于疫苗成分的不确定性，不同疫苗可能用的佐剂成分也不同。此类刺激物慎用！

附：刺激物类别一览

刺激物补充说明

T细胞、B细胞表面具有识别抗原的受体和有丝分裂原受体，在特异性抗原刺激下可使相应淋巴细胞克隆发生增殖。植物血凝素（PHA）、刀豆蛋白A（ConA），抗CD2、抗CD3McAb作为多克隆刺激剂可选择性地刺激T细胞增殖；而抗IgM、含葡萄球菌A蛋白的菌体（SAC）、脂多糖（LPS，对小鼠有作用）则刺激B细胞发生增殖；美洲商陆（PWM）、肿瘤刺激剂PMA对 T、B细胞的增殖均有刺激作用。最近发现，integrin家族中VLA组中某些受体与相应配体结合后也能活化T细胞。

PHA、ConA、LPS等在正式实验前均需摸索最适剂量或亚适剂量。不同厂家和批号的丝裂原作用常有很大差别。根据实验需要，对不同种（人、小鼠、大鼠、兔、狗等）不同来源淋巴细胞（胸腺、脾脏、淋巴结、扁桃腺、外周血等）均应进行最适细胞浓度、培养时间和刺激物浓度的摸索。

CD28白细胞表面分化抗原28（CD28）分子存在于大多数T细胞表面，被认为是一种T细胞特有的表面分子。T细胞对抗原的反应性主要通过CD3-T细胞抗原受体（TCR）复合物介导，但也有赖于T细胞表面其他分子的协同。T细胞可通过CD3-TCR、CD2和CD28等多种途径被有效激活。自1980年CD28分子首次被Hansen等用单克隆抗体(单抗)9.0发现以来，国外学者对其作了大量研究，认为CD28的生物学活性主要表现于在T细胞激活中发挥共刺激(co-stimulate)作用，以及与此有关的调节细胞因子产生等功能。

阳性刺激物

常用阳性刺激物一览表

为了达到合适的斑点便于斑点计数，阳性对照孔不建议加入过多细胞数。阳性刺激物不同，阳性对照中的细胞数也不同，例如，CEF肽库、CEF扩展肽库和CEFTA肽库的抗原刺激阳性对照孔推荐接种细胞数大约250,000个/孔，PHA等刺激物推荐接种细胞数大约40,000 – 80,000个/孔。

T细胞阳性刺激物

多克隆刺激物

anti-CD3 抗体可用作T细胞的多克隆激活剂。Mabtech 提供针对人和猴CD3 的单克隆抗体，可引发多种细胞因子的释放，包括 IFN-γ、IL-2、IL-4、IL-5、IL-10、IL-13 和 IL-17A。使用在体外生产的单克隆抗体这一事实确保了低批次变异性。

PBMC细胞IFN-γ ELISpot。细胞数50,000/孔，孵育20h，左图未加刺激物，右图加入anti-CD3 (1:1000) 刺激物。

凝集素如植物血凝素 (PHA) 和刀豆球蛋白 A (ConA) 等是有效的T细胞激活剂。PHA和ConA可从许多不同的供应商处购买，并且可以以不同程度的效力购买。

抗原特异性刺激

CEF肽库由23种病毒肽组成，可刺激人CD8 + T细胞优先产生IFN-γ反应。这些肽含有来自CMV、EBV和流感病毒的MHC I类限制性T细胞表位肽，旨在刺激具有各种HLA类型供体的T细胞。它还在许多个体的B细胞中引发穿孔素和颗粒酶的分泌。CEF肽库也作为国际标准阳性刺激物用于标准化程序。

CEF扩展肽库由32种病毒肽组成，可刺激人CD8+ T细胞优先产生IFN-γ 反应。这些肽含有来自 CMV、EBV 和流感病毒的 MHC I类限制性T细胞表位肽，旨在刺激具有各种HLA 类型供体的T细胞。它还在许多个体的B细胞中引发穿孔素和粒酶分泌。

CEFTA肽库由来自人类CMV、EBV、流感病毒、破伤风毒素和腺病毒5的35种 MHC II类限制性病毒肽组成。CEFTA肽库刺激人CD4+ T细胞产生IFN-γ、IL-2、IL- 5和IL-13。

CMV肽库由来自人类CMV的42个MHC I类和II类限制性病毒肽组成。CMV肽库刺激人CD4+和CD8+T细胞产生例如 IFN-γ、IL-2、IL-5 和 IL-13。

CEF肽池刺激人PBMC和各亚型T细胞分泌IFN- γ的作用。

单核细胞和树突状细胞阳性刺激物

TLR配体

Toll样受体 (TLRs) 的配体可用作刺激单核细胞和树突状细胞的阳性刺激物。从细菌中纯化的脂多糖 (LPS) 通过 TLR4发挥作用，并且是IL-1β、IL-6和TNF-α分泌的有效刺激物。化合物R848是TLR7/8的配体并刺激IL-1β的分泌。

附：参考资料

1. 朱义鑫,田增遂,施光华,等. ELISpot国际标准参照多肽池CEF对中国人PBMC的刺激以及建立国内标准ELISpot质控系统的设想[C]. //第二届全国现代免疫诊断技术学术研讨会论文汇编. 2005:98-106.

2. https://www.mabtech.com/knowledge-center/tutorials-and-guidelines/assay-controls-elispot-and-fluorospot