CREG1促进溶酶体的生物发生、酸化和降解

文献导读

2021年5月8日，来自美国罗格斯大学罗伯特伍德约翰逊医学院的Leonard Y Lee和Shaohua Li教授在《Autophagy》上联合发表了题为“CREG1 promotes lysosomal biogenesis and function”的文章。

研究介绍

E1A激活基因抑制子（CREG）最初被认为是一种转录抑制因子，后来发现CREG是一种可以分泌到细胞培养基中的糖蛋白，分为CREG1和CREG2。CREG1对胚胎发育和正常生理至关重要，其失调与各种疾病有关，包括神经退行性变、糖尿病和癌症。然而，人们对CREG1在自噬中的作用知之甚少。因此，作者对其功能进行了探讨。

CREG1蛋白在脾脏、肝脏、肺、白色脂肪组织以及白细胞和骨髓中均高表达。超量表达实验表明，CREG1主要靶向于核内质溶酶体室。通过对LO2肝细胞中的内源性CREG1进行了免疫染色，作者确定CREG1是一种核内质溶酶体蛋白。进一步地，作者发现N端糖基化是CREG1从内质网运输到内质网-溶酶体室所必需的。为了确定小鼠胚胎发育过程中CREG1的定位，作者用CREG1抗体与核内质和溶酶体隔间的标记物共免疫染色E7.5小鼠胚胎。CREG1定位于囊泡的顶端，在内脏内胚层细胞中呈点状高表达。小鼠胚胎在内脏卵黄囊发育的后期，内体室发育良好，由管状和囊状结构组成。在E16.5内脏卵黄囊内，CREG1在内胚层细胞顶端的泡状结构中高水平表达。内脏内胚层主要参与营养吸收和降解，为胎儿提供氨基酸和其他营养物质。为了完成这些功能，内脏内胚层细胞在顶端形成大量突出的空泡(包含溶酶体蛋白)，并通过大胞吞作用和其他形式的内吞作用，积极内化母体免疫球蛋白。因此，作者对内脏卵黄囊共进行了CREG1和IgG的免疫染色，并观察到IgG与CREG1在内胚层细胞顶端共定位，CREG1也与溶酶体膜蛋白LAMP2共定位于内脏内胚层的基底侧。这表明，CREG1可能在胞吞作用以及内体分选和转运中发挥重要作用。

为了确定CREG1是否参与肝细胞的大胞吞作用和其他形式的内吞作用，作者将人CREG1和控制载体分别和人干细胞LO2转染并在示踪剂TRITIC-dextran中孵化。结果表明，超量表达CREG1显著增加了LO2细胞对这些示踪剂的摄取。之后，脉冲追逐（pulse-chase）实验和功能丧失分析（loss-of-function analysis）的结果表明CREG1可以促进大胞吞作用，格行蛋白依赖性内吞作用和内吞运输。

超量表达CREG1增加了内吞运输以及CREG1与溶酶体标记的共定位。这表明，CREG1可能促进溶酶体生成。免疫印迹实验发现，人干细胞中超量表达CREG1增加了LAMP1、ATP6V1H、CTSC、preproCTSD和CTSD的表达。溶酶体蛋白的上调可能发生在转录后，因为它们的mRNA转录本没有增加。在AML12小鼠肝细胞中，敲除CREG1降低了LAMP1、ATP6V1H、CTSD和HEXA的表达，相比之下，这些蛋白质的mRNA转录本要么没有变化，要么略有增加。为了进一步证实CREG1在体内对溶酶体生物发生的调控，作者使用CRISPR技术通过在1-3外显子侧插入loxP位点得到CREG1 floxed小鼠。进一步与UBC-Cre/ERT2小鼠（在8周龄时腹腔注射他莫昔酚删除Creg1基因）杂交得到Creg1fl/fl小鼠，将creg1敲除小鼠与野生型C57BL/6小鼠杂交，得到了Creg1 +/-小鼠。检测creg1-/-小鼠肝脏溶酶体蛋白的表达发现敲除CREG1降低了ATP6V1H、CTSC、CTSD和HEXA的表达。这些结果说明CREG1在溶酶体生物发生中起着重要作用。

核内体的酸化对于内化配体-受体复合物的解离和受体的再循环是必不可少的。作者发现CREG1可以促进了内吞-溶酶体室的酸化。溶酶体的主要功能是通过内吞/吞噬作用消化细胞外吞噬的物质，以及通过自噬消化细胞不需要的成分。为了确定CREG1诱导的溶酶体生物发生和酸化是否对溶酶体功能有影响，作者通过免疫染色对SQSTM1/p62 (sequestosome 1)进行了氨基酸剥夺诱导自噬分析。LO2细胞的细胞质中检测到高水平的SQSTM1呈点状分布，而超量表达CREG1导致SQSTM1聚集物的显著减少。氯喹抑制了溶酶体活性，阻断了SQSTM1的减少。这表明，CREG1超量表达诱导的SQSTM1减少是由于溶酶体降解加速所致。综上所述，超量表达CREG1主要通过增强溶酶体介导的降解来促进自噬。功能获得和丢失分析显示，CREG1促进溶酶体生物发生、酸化和降解，从而加速自噬通量。这些作用可能是由增强的内吞运输介导的。

细胞自噬

细胞自噬（autophagy）是一个吞噬自身细胞质蛋白或细胞器并使其包被进入囊泡，并与溶酶体融合形成自噬溶酶体，降解其所包裹的内容物的过程，藉此实现细胞本身的代谢需要和某些细胞器的更新。自噬在机体的生理和病理过程中都能见到，其所起的作用是正面还是负面的尚未完全阐明，例如：细胞在饥饿过程中会启动自噬，但是也与许多病理过程相关比，如发育、分化、神经退行性疾病、应激、感染以及癌症。mTOR 激酶是诱导自噬的重要调节分子，通过mTOR激活Akt 和 MAPK 信号转导可以抑制自噬，而激活AMPK 和 p53 信号转导则会促进自噬。在哺乳动物细胞中ULK1、ULK2、UKL3最为mTOR的下游，会激活自噬发生的重要复合体PI3K 形成，促进LC3-I 和LC3-II形成，调控自噬的发生。综合目前的研究发现，LC3-II、Beclin-1和P62均可作为自噬发生检测的标志物。

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