杂交瘤技术方法的建立和融合条件的研究

湖南医科大学学报

BU L 

L. 

O 

F 

HU N 

A 

N 

M ED

. 

U N 

I

V. 

1997, 22 

( 

2

)

179 

杂交瘤技术方法的建立和融合条件的研究

①

潘赛贻

黄健康

周洁娴

①

(

广东

省

寄

生

虫

病

防

治

研究

所

广州

510300

) 

吴建民

(

湖南

医

科

大

学

流

行病

学

教

研

室

长沙

410078

)

提要

通过制备抗华支睾吸虫单克隆抗体

, 

建立和稳定了淋巴细胞杂交瘤技术方法

, 

并对影响融合

效果的融合条件进行了观察

。

聚乙二醇浓度

、

新生牛血清质量

、

更换

HA T 

培养基的时间等因素对融合效

果有影响

。

筛选了

5

株分泌高滴度单克隆抗体的杂交瘤细胞株

。

关键词

杂交瘤技术

; 

单克隆抗体

; 

华支睾吸虫

;

中图号

R 

392

1

12

方法

杂交瘤技术和单克隆抗体已广泛应用于疾

病的免疫诊断

、

免疫治疗和免疫预防等各个领

域

1 

。

为了开展华支睾吸虫免疫诊断研究

, 

提高

华支睾吸虫病诊断方法的特异性和考核药物疗

效

, 

作者拟制备抗华支睾吸虫的单克隆抗体进

行华支睾吸虫病的免疫诊断

, 

为此对杂交瘤细

胞融合条件进行了探讨

, 

并建立和稳定了此技

术方法

。

离心

、

超声粉碎等步骤制成可溶性抗原

。

免疫方法采用

每

鼠

155

Λ

g 

可

溶

性

抗

原

加

佛

氏

完

全

佐

剂

腹

腔

注

射

BA L B 

ƒ

C  

小鼠

, 

基础免疫两次

, 

间隔

3

-   4

周

, 

融合前

3

天

以加倍抗原量不加佐剂腹腔注射加强免疫

。

融合

2 

～

4

1

1

3 

1

1

3

1

1 

骨髓瘤细胞

SP 

2

10 

融合前一周从液氮取出

SP 

2

10

细胞

, 

解冻培养于

20% 

新生牛血清培养基中

, 

融

合前一天换液一次

, 

使细胞处于对数生长期

。

1

1

3

1

2    

免疫脾细胞

取

2

～

3

只已加强免疫的

BA 

L

 B 

ƒ

C 

鼠

, 

摘除眼球致死

, 75% 

酒精浸泡消毒

, 

取脾置内有

100 

目不锈网筛的小平皿内

, 

用注

射器

内芯研碎

, 

加

10

m l 

无血清培养基

, 

置冰浴中自然沉淀

5

m in 

, 

取上半部

分

, 

以少许伊文思蓝染色计细胞数

, 

离心

, 

用无血清培

养基配成悬液置冰浴中备用

。

1

1

3

1

3   

饲养细胞

融合前一天

, 

取

6 

周龄普通小白鼠

腹腔注射

5

m 

l 

无血清培养基

, 

轻揉腹部

50

次

, 

取出后离

心

1000

r

r

m in

-  1 

,  

5

m in 

, 

取细胞数

3

～

5

×

10

6 

加

12

m l 

完全

培养基

, 

滴加于一块

96

孔进口培养板

。

1 

材料与方法

1

1

1 

动物与试剂

家兔购自中山医科大学实验动物

中心

; 

BA 

L

B

ƒ

C  

雌性小鼠

( 

8

～

10

周龄

, 

体重

18

～

20

g 

)

及

BA 

L

B

ƒ

C  

经产鼠均购自中山医科大学实验动物中心

; 

普通小白鼠由本单位动物场提供

。

佛氏完全佐剂为

S 

i

g

2 

m a 

产品

; 

聚乙二醇

(

P 

E

G

)

为

S 

i

g

m a 

产品

, 

分子量

4000; 

次黄嘌呤

(

H 

) 

为上海试剂二厂产品

; 

氨基喋呤

(

A 

) 

和胸

腺嘧啶

(

T 

) 

均为瑞士产品

; 

新生牛血清分别购自中山医

科大学

、

第一军医大学和广东省某农场

; 

骨髓瘤细胞

SP 

2

10

引自中山医科大学寄生虫学教研室

, 

经本室传代

培养保存于液氮中

。

1

1

3

1

4 

融合方法

5, 6

取

1 

×

10

7  

SP 

2

10 

细

胞和

1 

×

10

8

免疫脾细胞混合于

50

m l 

尖底离心管中

, 1000 

r

r

m in

-  

1 

离

心

10

m in 

,

 50%  

P 

E

G

作融合剂

, 

融合用

25

m l 

完全培养基

将细胞悬起

, 

滴加于两块含有饲养细胞的培养板

, 

置

37

℃

5%  CO 

2 

培养箱内培养

。

1

1

4    

杂交瘤细胞培养

细胞融合后

, 

先在完全培养基

1

1

2 

制备华支睾吸虫成虫可溶性抗原和免疫

BA 

L

B

ƒ

C 

鼠

用华支睾吸虫囊蚴感染家兔

, 

从家兔肝胆管中分

离并收集华支睾吸虫成虫

, 

用生理盐水漂洗

, 

经研磨

、

1996

2

11

2

28    

收稿

①本课题为广东省医药卫生科研基金资助项目

( 

编号

951008

)