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我这一段做双夹心法ELISA，发现只能检测到浓度为100ng/mL的样品，如果浓度再低时就无法测到了。那时阴性对照的OD值有时甚至高于样品，请各位指点一下。你的两种抗体针对的抗原决定簇是否相同？如果相同，降低包被抗体的浓度试一下。道理如此：如果包被抗体浓度过高，而抗原浓度低时，抗体则与抗原的大多数或全部抗原决定簇结合，导致标记抗体不能与抗原结合。谢谢回复。我用的包被抗体是单抗，一抗则是多抗，包被抗体是将买来的抗体1：10000稀释后使用的，应该不会浓度过高吧。其他还会有什么因素吗？maqingwen wrote: 谢谢回复。我用的包被抗体是单抗，一抗则是多抗，包被抗体是将买来的抗体1：10000稀释后使用的，应该不会浓度过高吧。其他还会有什么因素吗？ 为什么包被抗体是单抗而一抗是多抗，这样放大倍数会不够吧。 我认为，你的一抗应该针对研究的抗原决定簇，而二抗应该是抗一抗的多个决定簇，这样就会将底物放大很多倍，而且还会比你现在的特异性强，就避免了阴性对照过强。 要是不能换抗体的话，试试调整实验条件：包被时间，调整浓度，增加洗脱次数，增加抚育时间，，， 不知对否！ 是不是指把包被抗体和一抗倒过来使用，即包被用多抗而一抗用单抗？另外，各位能不能给个你们实验的流程供我参考，谢谢！"包被抗体是将买来的抗体1：10000稀释后使用的，应该不会浓度过高吧。"这种说法太主观。有些抗体的浓度很高，在ELISA时要做系列浓度摸索。因为在你的实验中，抗原浓度是未知的，因此，可如下：取一固定抗原浓度（要低一点，如100ug/ml），而把抗体浓度做不同浓度稀释，如：1：10000，1：20000，1：30000等。然后ELISA，找出能检测到抗原明显反应的抗体浓度，即为最适包被抗体浓度。 Fang CY wrote: 你的两种抗体针对的抗原决定簇是否相同？如果相同，降低包被抗体的浓度试一下。道理如此：如果包被抗体浓度过高，而抗原浓度低时，抗体则与抗原的大多数或全部抗原决定簇结合，导致标记抗体不能与抗原结合。你的意思是一抗与二抗全是抗底物的? 那你还用一抗干什么,直接用二抗的了! Frederic wrote: 为什么包被抗体是单抗而一抗是多抗，这样放大倍数会不够吧。 我认为，你的一抗应该针对研究的抗原决定簇，而二抗应该是抗一抗的多个决定簇，这样就会将底物放大很多倍，而且还会比你现在的特异性强，就避免了阴性对照过强。要是不能换抗体的话，试试调整实验条件：包被时间，调整浓度，增加洗脱次数，增加抚育时间，，， 不知对否！ Fredreic 兄，Fang cy是说对了的，maqingwen用的是“双抗体夹心法”！再去看看吧各位觉得包被抗体和一抗的浓度比例多少合适？二抗是不是低一点有利于减少阴性的非特异性显色？maqingwen wrote: 各位觉得包被抗体和一抗的浓度比例多少合适？二抗是不是低一点有利于减少阴性的非特异性显色？减少染色时间，增加洗脱液的体积及洗脱次数、强度。 能说得具体一点吗？比如洗脱液用哪一种，反应时间缩短多少可能好一点？我觉得是否可以用内参比法，就是在样本中加入一些标准品，这样，使所检测的范围在你的试剂灵敏度范围内，等于是提高了灵敏度这种方法可信度如何？如果样品中待测抗原的浓度很低的话，你用内参法得出的结果很可能是测定的误差造成的。各位说得有道理，我在这里想说的是，很多公司提供的单抗，其实里面有其他蛋白质，因为纯化的抗体保存时如果没有其他蛋白质，极易沉淀，并导致效价下降。你买的单抗可能含有其它蛋白质，因此，包被时，你的单抗可能只有一部分吸咐在酶标板上，这样当然敏感性不够高。 此外，我以前做ELISA时。一般是包被抗体用多抗，检测抗体用单抗，这样包被抗体可以捕获较多的抗原，而单抗作为检测抗体，可以保证其较低的本底。仅供参考！ |
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