酵母表达系统制备病毒样颗粒（VLPs）研究进展

图2：酵母制备疫苗种类

VLPs在不同表达系统制备的比较：

表1比较了用于生产VLPs的大肠杆菌、哺乳动物细胞、昆虫细胞和酵母表达系统的特性。大肠杆菌是一个有优势的表达系统，因为它可以高水平的表达外源蛋白，但是靶蛋白的低溶解度及不正确的折叠阻碍了它的实际应用。此外，在生产可注射疫苗时，内毒素污染是一个重要的考虑因素，因为它会导致严重的副作用，如败血症性休克和组织损伤。

哺乳动物细胞和昆虫细胞不仅可以用于蛋白细胞内表达，还可用于分泌表达外源蛋白质。从理论上讲，哺乳动物细胞能够表达多种VLPs，不仅可以生产非包膜病毒VLPs还可以生产包膜病毒的VLPs。因为它能产生类似天然病毒离子的VLPs，哺乳动物表达系统可能是最好的选择。然而，高昂的生产成本是此类VLPs商业化最大的障碍。昆虫细胞是另一种真核表达系统，它既能产生无包膜的VLP，也能产生有包膜的VLPs，但是使用重组杆状病毒株进行表达需要滴定以及在感染前对菌株进行预测试，这使得生产非常耗时。此外，昆虫细胞的培养基与哺乳动物细胞的培养基一样昂贵，还有一个问题是生产的VLPs受感染昆虫细胞出芽释放的杆状病毒颗粒的污染。因此，杆状病毒的去除和灭活是工艺设计中的一个重要问题。酵母是一种单细胞真核微生物，具有原核细胞和真核细胞的一些特性。酵母表达系统的主要优点是它提供真核生物翻译后修饰（PTM）过程，允许像大肠杆菌一样快速生长，并且不需要昂贵的培养基。它有一个内质网（ER），作为蛋白质正确折叠的监控系统，因此可以获得高质量的重组蛋白质。

酵母表达系统制备VLPs

酵母中制备了30多种VLPs，其中大多数是酿酒酵母，其次是毕赤酵母，然后是多型汉森酵母（见表2）。在过去的几年中，VLPs生产策略的显著变化包括通过分泌产生的VLPs数量的增加，以及由一种以上结构蛋白组成的VLPs的生产。

VLPs的分泌表达

在酵母种也有一些分泌表达VLPs的案例，其中有包膜病毒和非包膜病毒（表2）。大多数分泌型VLPs的表达都是在P.pastoris中，其主要优点是它能够产生和分泌高滴度的异源蛋白质。然而，在复杂蛋白或易发生蛋白水解/降解的情况下，重组蛋白在P.pastoris中的分泌表达常常产量很低。最近的一份报告描述了兔出血症病毒VP1衣壳蛋白在P.pastoris中通过分泌途径表达时会出现降解。有文献表明在发酵过程中加入一种叫做BPTI-Kunitz型蛋白酶抑制剂或其与衣壳蛋白共表达时可显著降低蛋白质降解。

一个研究小组在P.pastoris中成功地分泌表达了诺如病毒的主要结构蛋白VP1，他们利用afactor作为信号肽分泌表达VP1，得到直径为40nm的VLPs。另外，也有人报道了登革热病毒包膜糖蛋白E和膜前蛋白的分泌表达，以及这些蛋白在P.pastoris中形成VLPs。因此，近年来在酵母分泌表达VLPs生产方面取得了相当大的成功。酵母中VLPs和病毒结构蛋白的分泌途径在很大程度上仍然是未知的，将来对这些途径的进一步了解可以有利于分泌表达更多类型的VLPs。

酵母表达多结构蛋白VLPs

从包膜病毒或非包膜病毒中获得的VLPs又可分为单个和多个结构蛋白VLPs。在酿酒酵母中，已表达出细小病毒B19、腺相关病毒和人博卡病毒的多结构蛋白VLPs，属于细小病毒科。人细小病毒B19的衣壳由主要衣壳蛋白VP2和小衣壳蛋白VP1组成，VP2被认为占整个衣壳结构的95%。在酿酒酵母中，自主生产的VP2蛋白可以有效地组装成VLPs。最近，有人认为，VLPs中VP1的存在有助于诱导中和抗体反应。当VP1和VP2在酿酒酵母中共同表达时，两个结构蛋白在同一启动子（ADH2/GAPDH）的共同表达导致可溶性VP2的表达水平降低。研究表明当把控制VP1表达的GAPDH启动子部分TATAbox侧翼的33碱基对缺失抑制时，可溶性VP2的产量显著增加。因此，控制两种衣壳蛋白表达之间的平衡显得至关重要。

表达质粒有两种不同的构建策略。一种是使用两种独立的表达质粒，一种用于生产P1区，另一种用于3CD蛋白酶。另一种策略是为两个区域使用单个表达质粒。在这两种情况下，所生产的VLPs都有可能作为疫苗。与用两种分离质粒转化的细胞相比，用单表达质粒转化的细胞获得的抗原表达明显高于两种独立质粒的表达。总的来说，证据表明，表达质粒、多结构蛋白的比例、病毒蛋白酶的存在以及启动子的选择是在酵母中制备多结构蛋白VLPs的关键因素。

酵母源VLPs作为抗原、核酸和药物的传递系统

VLPs内部的空间及其重复结构为运输其他材料提供了巨大的潜力。目前开发了基于VLPs的输送各种外来抗原和核酸的策略，表3给出了酵母源性VLPs用于抗原和核酸输送的实例。有两种运送外来抗原的策略（表3）：一种是利用基因工程技术在VLPs表面展示异源表位，另一种是通过化学偶联在VLPs表面展示异源表位。

关于酵母源VLPs工艺设计应注意问题

已知病毒的组装依赖于细胞的活性成分和细胞所处的条件。细胞伴侣调和细胞氧化还原状态被认为会影响病毒的组装、成熟和释放。分子伴侣可以从根本上影响蛋白质的折叠和展开，并参与蛋白质的组装和降解，它们还可以调节VLPs的表达。同时VLPs的组装和成熟受到各种体外条件的影响，如温度、盐浓度和pH值等，VLPs的稳定性受缓冲液成分的影响。所有这些都意味着培养条件和纯化条件都会影响VLPs的结构特性，后者可以决定性地影响VLPs的免疫原性和抗原性，因此，VLPs的工艺设计应慎重考虑这些因素。

结论

酵母表达系统在VLPs生产方面比大肠杆菌和哺乳动物表达系统有明显优点：酵母生长速度快，产生的蛋白质质量高，成本低。酵母不仅支持单个和多个结构蛋白VLPs的产生，而且支持VLPs的胞内和分泌表达。质粒的使用、启动子的类型、蛋白降解的控制以及不同结构蛋白的相对表达等因素都会影响酵母表达VLPs的质量和数量。此外，所选择的培养策略和纯化过程会影响产生的VLPs的结构、抗原性和免疫原性。因此，优化这些因素有助于提高酵母生产VLPs的成功率。

参考文献：

1.H.J. Kim and H.-J. Kim，Yeast as an expression system for producing virus-like particles:what factors do we need to consider? Letters in Applied Microbiology ISSN0266-8254

2.Ravinder Kumar1, and PiyushKumar ，Yeast-based vaccines: New perspective in vaccinedevelopment and application，FEMS Yeast Research, 19,2019, foz007

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