基于ZIF

基于MOFs纳米载体的盐酸多柔比星/盐酸维拉帕米共给药系统用于克服肿瘤多药耐药性、实现靶向抗肿瘤治疗研究　　在水溶液中通过原位“一锅煮”方法合成荷载盐酸多柔比星(DOX)和盐酸维拉帕米(VER)两种药物的ZIF-8药物共递送纳米粒，并通过配位作用实现聚乙二醇-叶酸(PEG-FA)在纳米粒表面的修饰，构建肿瘤细胞主动靶向纳米粒PEG-FA/(DOX+VER)@ZIF-8。对合成的PEG-FA/(DOX+VER)@ZIF-8进行体外基础表征，考察其晶体结构、热稳定性、纳米粒形态、粒径分布和Zeta电势。X射线粉末衍射结果显示PEG-FA/(DOX+VER)@ZIF-8具有良好的晶型，热重分析结果证实制剂具有较高的热稳定性，相关结果可以验证ZIF-8金属有机框架结构的成功合成。透射电子显微镜(TEM)图片显示PEG-FA/(DOX+VER)@ZIF-8纳米粒为均匀类球形，动态光散射(DLS)测定纳米粒粒径约为185.0nm(PDI=0.005)，满足EPR效应要求。PEG-FA/(DOX+VER)@ZIF-8纳米粒在水溶液中的Zeta电势为-（34.50±7.43）mV。通过紫外分光光度法测定(DOX+VER)@ZIF-8的载药量，其中DOX和VER的载药量分别为8.9％和32.0％。选择pH值为5.0和7.4的PBS作为释放介质进行体外释放实验，在相同时间内，浸没于pH=5.0的PBS中的(DOX+VER)@ZIF-8相比浸没于pH=7.4的PBS中的样品释放出更多的DOX和VER，验证了(DOX+VER)@ZIF-8的pH响应性释药行为。　　选取高表达FA受体的MCF-7细胞和耐药的MCF-7/ADR细胞，评价制剂的细胞摄取情况。荧光倒置显微镜图片和流式细胞术结果共同说明了细胞对PEG-FA/(DOX+VER)@ZIF-8具有较高的摄取行为。并通过对比实验验证了FA受体介导的内吞作用和VER介导的逆转多药耐药作用对化疗药物DOX摄取的改善。采用噻唑蓝比色法(MTT法)研究制剂对多种肿瘤细胞的体外细胞毒性，实验结果显示，与DOX原料药和制剂DOX@ZIF-8相比，PEG-FA/(DOX+VER)@ZIF-8可以导致更高的肿瘤细胞生长抑制率。通过近红外荧光活体成像法监测制剂在荷瘤小鼠体内的生物分布情况，相关结果表明，PEG-FA/ZIF-8可以作为肿瘤主动靶向药物载体延长药物在体内的循环、增加药物在肿瘤部位蓄积。在体内抗肿瘤评价中，比较了不同制剂的体内抗肿瘤疗效和毒副作用，PEG-FA/(DOX+VER)@ZIF-8具有最高的抑瘤率，此外，苏木精和伊红(H&E)染色结果验证了该制剂对小鼠的主要脏器具有较低的系统毒性。　　基于普适性前药策略构建载阿糖胞苷-新吲哚菁绿前药的ZIF-8纳米粒及其在化疗-光热治疗联合抗肿瘤治疗的应用　　以6-氨基己酸作为连接链合成阿糖胞苷-新吲哚菁绿（Ara-IR820）小分子前药并采用硅胶柱色谱法提纯产物。使用核磁共振氢谱法(1H NMR)和质谱法(MS)对中间产物和最终产物进行化学结构鉴定，证明合成成功。通过原位“一锅煮”方法合成荷载Ara-IR820小分子前药的ZIF-8药物递送纳米粒，最后实现透明质酸(HA)在Ara-IR820@ZIF-8纳米粒表面的修饰，制得肿瘤主动靶向纳米粒HA/Ara-IR820@ZIF-8。对合成的HA/Ara-IR820@ZIF-8进行体外表征，考察纳米粒形态、粒径分布和体外升温性能。TEM结果显示HA/Ara-IR820@ZIF-8纳米粒为均匀类球形形态，DLS测定纳米粒水动力学粒径约为132.0nm(PDI=0.086)，满足EPR效应要求。通过紫外分光光度法测定HA/Ara-IR820@ZIF-8的载药量，其中Ara-IR820的载药量约为39.8％。通过体外升温实验考察制剂光热性能，在等浓度下，HA/Ara-IR820@ZIF-8体外升温效果优于IR820水溶液，在5分钟1W/cm2的激光照射后，HA/Ara-IR820@ZIF-8(cIR820=118μM)水溶液温度可以升高26.7℃。考察HA/Ara-IR820@ZIF-8在pH=5.0和pH=7.4的PBS中的药物释放行为，结果验证了制剂的pH响应性释药特性。通过溶血实验对HA/Ara-IR820@ZIF-8作为静脉给药制剂的生物相容性和安全性进行初步评估，结果显示制剂溶血率低于5％，基本满足静脉注射给药的要求。　　选取高表达HA受体CD44的4T1细胞考察制剂的细胞摄取行为。荧光倒置显微镜图片和流式细胞术结果共同说明了细胞对HA/Ara-IR820@ZIF-8具有较高的摄取。通过竞争性抑制实验验证了CD44介导的内吞作用诱导肿瘤细胞对制剂的主动靶向摄取能力。采用MTT法验证HA/Ara-IR820@ZIF-8对肿瘤细胞的化疗疗效和光热治疗(PTT)疗效，结果显示，制剂可以通过化疗联合PTT表现出强大的细胞毒性。通过近红外荧光活体成像法监测制剂在荷瘤小鼠体内的生物分布情况，结果证实了HA/Ara-IR820@ZIF-8优异的肿瘤靶向蓄积能力，并确定了最佳光照时机用于荧光成像指导的PTT。构建小鼠皮下荷瘤模型，考察制剂的体内升温效果、抗肿瘤能力和系统毒性。HA/Ara-IR820@ZIF-8表现出高效的体内升温性能，可用于抗肿瘤PTT。体内抗肿瘤实验中，HA/Ara-IR820@ZIF-8可以极大程度地抑制肿瘤的生长，且对于治疗的小鼠具有较低的毒副作用。　　任务特异性MOFs混合纳米粒用于肿瘤细胞靶向治疗和树突细胞靶向免疫调节协同增强抗肿瘤免疫治疗的研究　　通过原位“一锅煮”方法分别合成了荷载IR820或共载咪喹莫特(R837)和1-甲基色氨酸(1MT)的ZIF-8纳米粒。HA修饰于IR820@ZIF-8表面进行功能化制得肿瘤细胞主动靶向纳米粒(HA/IR820@ZIF-8)。甘露聚糖（MAN）修饰于共载R837和1MT的ZIF-8纳米粒表面制得树突细胞(DCs)主动靶向纳米粒(MAN/(R837+1MT)@ZIF-8）。对制备的HA/IR820@ZIF-8和MAN/(R837+1MT)@ZIF-8进行体外表征，考察其晶体结构、纳米粒形态、水溶液中的粒径分布和Zeta电势。TEM图像显示HA/IR820@ZIF-8和MAN/(R837+1MT)@ZIF-8均为粒径分布相对均匀的类球形形态。DLS测定HA/IR820@ZIF-8和MAN/(R837+1MT)@ZIF-8的水动力学粒径分别为120.0nm(PDI=0.119)和221.0nm(PDI=0.185)。紫外分光光度法测得HA/IR820@ZIF-8的载药量为34.4％，MAN/(R837+1MT)@ZIF-8中R837和1MT的载药量分别为8.9％和10.7％。体外升温实验验证了HA/IR820@ZIF-8优越的光热性能，具有应用于PTT的潜力。通过测定HA/IR820@ZIF-8和MAN/(R837+1MT)@ZIF-8混合制剂的溶血毒性，初步判定制剂满足用于静脉注射给药的可行性。　　细胞摄取实验显示出B16F10细胞对HA/IR820@ZIF-8较高的细胞摄取并验证了HA介导的肿瘤细胞主动靶向药物递送。此外，考察了B16F10细胞对HA/IR820@ZIF-8的摄取动力学，在给药4小时后，肿瘤细胞对纳米粒的摄取达到较高水平，可以进行激光照射用于PTT。采用MTT法和细胞凋亡实验研究制剂HA/IR820@ZIF-8对肿瘤细胞的暗毒性和光毒性。在未经激光照射时，制剂对B16F10细胞的细胞毒性较低，而在激光照射条件下，HA/IR820@ZIF-8表现出较高的肿瘤细胞光毒性，并可以诱导严重的细胞凋亡。对HA/IR820@ZIF-8引起肿瘤细胞免疫原性死亡(ICD)的能力进行评价，通过免疫荧光染色法检测钙网蛋白(CRT)的表达，实验结果证明，基于HA/IR820@ZIF-8的PTT可以有效地引发肿瘤细胞ICD，触发抗肿瘤免疫反应。通过细胞摄取实验考察骨髓来源树突细胞(BMDCs)对MAN/(R837+1MT)@ZIF-8的细胞摄取行为，并验证了MAN介导的DCs主动靶向药物递送。考察了MAN/(R837+1MT)@ZIF-8或1MT培养后DCs培养基中犬尿氨酸(kyn)的含量，结果显示1MT原料药和MAN/(R837+1MT)@ZIF-8制剂对kyn均具有较高的抑制率，可以有效地抑制免疫抑制性吲哚胺2，3-双加氧酶(IDO)通路。通过检测树突细胞表面CD80和CD86的表达以及细胞培养基中代表性细胞因子肿瘤坏死因子α(TNF-α)和白细胞介素6(IL-6)的浓度，验证了MAN/(R837+1MT)@ZIF-8和PTT后的肿瘤细胞残渣对DCs成熟的刺激作用。结果证明了由HA/IR820@ZIF-8和MAN/(R837+1MT)@ZIF-8构成的混合制剂可以有效地激活抗肿瘤免疫反应。　　综上，本课题设计构建了三种基于MOFs的主动靶向纳米药物递送平台用于多功能抗肿瘤治疗，针对性地解决了肿瘤化学治疗多药耐药问题、MOFs载药局限性问题以及抗肿瘤免疫治疗中多靶点、疗效低的问题。本研究不仅提供了新型、高效及多功能的抗肿瘤纳米平台，在肿瘤治疗领域具有广阔应用前景，并为MOFs这类重要载体材料在生物医药领域的应用提供了新思路。