常见分子克隆应用和策略

分子克隆方法依赖于自然界中的分子生物学过程。这些技术经过不断完善和简化，因此，如今许多克隆策略能够更高效地从来源克隆得到目标序列。这些克隆策略包括：

PCR 克隆方法可将经过 PCR 扩增的双链 DNA 片段直接连接到载体上。而传统克隆方法需要使用限制性内切酶消化双链DNA插入片段以产生兼容的末端，之后纯化和分离足量片段并连接到经过相似处理的指定载体上（见插入片段制备），PCR 克隆法也因此比传统克隆方法更具优势。

PCR 克隆法使用 PCR 扩增技术，可减少起始模板材料的需求量，包括 cDNA、基因组 DNA 或其他携带插入片段的质粒（参见亚克隆基础）。此外，PCR 克隆方法无需选择合适的限制性酶切位点以及载体与插入片段之间的兼容性，提供了更简单的工作流程。但是，该方法也有许多需要注意的相关因素：PCR 引物和扩增条件、所选克隆方法和使用的克隆载体、成功克隆和转化的最终验证。

关于目标序列的 PCR 扩增，必须按照对模板的高效和特异性扩增来设计引物并优化PCR条件（组分和循环）。引物设计工具可用于生物信息学评估和选择合适的靶标特异性引物序列以进行扩增。连接需要插入片段或载体具有 5’-磷酸化末端；因此，如果克隆载体缺少 5’-磷酸化末端，则必须在引物合成期间或使用 T4 多聚核苷酸激酶将 5’-磷酸基团添加到PCR引物上，以便进行成功连接。反应组分浓度、退火温度和模板量都是 PCR 优化的重要因素。

TA 克隆和平端克隆代表了两种最简单的 PCR 克隆方法。它们的选用取决于克隆中所用载体的性质和 PCR 酶的类型。TA 克隆适用于可扩增短DNA序列的热稳定 Taq DNA聚合酶。该酶缺乏 3’→5’ 校对活性，并具有可在扩增子 3’ 末端（3’dA）额外添加脱氧腺嘌呤的末端转移酶活性。得到的具有 3′ dA 突出端的 PCR 产物易于克隆到含有互补 3’ 脱氧胸腺嘧啶（3’dT）突出端的线性TA 克隆载体中（图 1）。尽管该方法相对简单，但也具有一定的局限性，包括插入片段长度（最长 5 kb）、不能定向克隆插入片段以及Taq DNA聚合酶扩增高错误率（约 1.1 x 104至8.9 x 10–5错配率/bp）。

平端克隆指将插入片段连接到线性载体中，其中两个 DNA 片段都缺少突出端。使用具有 3’→5’ 核酸外切酶或具有校对活性的高保真 DNA 聚合酶能够获得平端插入片段。它们的校正活性能够提高扩增产物的序列准确性；但是，也具有一些局限性，包括插入到平端克隆载体时的连接效率较低以及无法定向克隆。通过将扩增子与 Taq DNA 聚合酶和 dATP 一起孵育（在 72℃ 下孵育 20-30 分钟）（这一过程被称为 “3′ dA加尾“），然后纯化含 3′ dA 尾部结构的产物，可提高连接效率（图 1）。

为了进一步简化分子克隆实验流程，已经专门开发了特殊的载体来将插入目的片段，例如，不使用连接酶的载体。这样一类载体包括 Invitrogen™ TOPO™ 克隆载体，其含有共价连接的DNA拓扑异构酶I，可同时作为限制性内切酶和连接酶（详细了解 TOPO 克隆技术）。与传统 PCR 克隆载体相比，这类载体具有更短的连接反应时间（如，5 分钟）、更高的克隆效率（如，>95％ 的阳性克隆）以及更简单的实验方案。此外，利用特异性引物设计得到的专用 TOPO 载体可实现 PCR 产物的定向克隆。

无论选择哪种克隆方法，在连接反应前纯化 PCR 扩增子都能显著提高克隆效率。凝胶纯化有助于去除盐、核苷酸、非特异性扩增子和引物二聚体。在连接并转化至合适的感受态细胞后，需要仔细筛选所得菌落以获得正确的插入片段及其合适的阅读框和方向，以便在后续研究中分析基因融合或蛋白质表达。

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亚克隆是指将质粒的一个片段转移至可作为载体的另一个质粒中。至于为什么有必要将目标片段转移至一个不同载体中，有很多原因。例如，新载体可能具有抗生素筛选或荧光表达的特异性标记物。亚克隆还可用于将一个克隆片段转移到一个更合适宿主的表达载体上（如，细菌、哺乳动物、昆虫、植物等）；将目标基因置于不同的表达启动子下（如，从组成型到诱导型启动子）；或者用另一种蛋白质或标记物来融合或标记实验基因。无论实验目的是什么，最常见的两种亚克隆方法始终是限制性酶切和PCR 克隆技术。

在这两种方法中，通过限制性酶切消化进行亚克隆较为传统。该实验流程利用两种限制性内切酶对载体和插入片段进行双重消化，生成粘性末端（图 2）。由于载体和插入片段只能沿一个方向（即定向）连接，并且载体的酶切末端不能自我连接，因此，与其他可选的限制性内切酶相比，这无疑是首选的和最常用的方法（参见插入片段制备）。对于用于蛋白质表达或基因调控研究中的亚克隆，选定的限制性内切酶应接近起始密码子的目标片段以实现阅读框克隆。

另一种常用方法是利用 PCR 技术扩增质粒的目标区域。随后，将所得 PCR 产物克隆到目标载体中。可使用 PCR 克隆部分所述的 TA 克隆或平端克隆方法，但这两种方法都不能维持插入片段的方向性。为了实现定向克隆，使用 5′ 末端设计有酶切位点的 PCR 引物，可将存在于亚克隆目标载体中的酶切位点整合到 PCR 扩增子中。在 PCR 反应后，将 PCR 产物进行限制性酶切消化、纯化并亚克隆到载体的限制性位点中。

设计 PCR 引物的限制性酶切位点时，有几点因素需要考虑。引入的酶切位点应该是唯一的，并且不存在于被亚克隆的片段的序列中。同时，应仔细设计酶切位点，从而使亚克隆 DNA 能够实现阅读框表达。当识别位点接近于线性 DNA 的末端时，会使大多数限制性内切酶的切割效率大大降低。为确保 PCR 片段的完全酶切，建议在引物限制性位点的 5′ 末端额外添加一个由 4-8 个核苷酸组成的序列（有时成为“前导”或“间隔”序列）（图3）。尽管尚未对最佳间隔序列达成共识，但一般建议避免使用可能导致生成引物二聚体或形成二级结构的序列（如，回文和反向重复序列）。此外，引物识别序列的设计应长于结合的酶切位点和间隔序列，以确保特异性及与靶标的准确结合。在计算引物的 Tm 时，应仅使用与模板完全匹配的序列。最后，使用长引物序列时，为确保获得全长 DNA 寡核苷酸，有必要纯化引物。

目前发明的其它亚克隆策略使用了无需限制性内切酶或连接酶的特殊载体。 Invitrogen™ Gateway™ 克隆就是使用这样一种策略，它利用了 Invitrogen™ Clonase™ 酶家族的独特重组活性（图4）。该方法使用经特殊设计的 Gateway 特异性质粒和与 Gateway 兼容的插入片段末端（att 位点）进行重组。

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在分子克隆中，DNA 文库构建是指创建代表一个物种完整基因组 (gDNA)的DNA片段克隆或代表所表达基因组的RNA转录物互补DNA（cDNA）的克隆。通过构建 DNA 文库，可轻松归档数千个基因片段，用于基因分型和表型筛选等下游实验应用。gDNA 文库作为一种实用工具，可用于研究不同物种的基因组成或癌症等疾病中的基因突变； cDNA 文库可用于基于细胞类型、组织来源（空间）以及时间点（时间）的基因和转录物变异表达分析。

gDNA 和 cDNA 文库的构建具有许多相似之处，但也有一些重要区别。这两种方法都包括核酸纯化、样品制备（如，限制性酶切）、载体克隆、将载体引入合适宿主（如，转化或转导）和克隆筛选。由于 gDNA 和 cDNA 的起始材料不同，所以它们的纯化和制备方法也不同；但是，在 gDNA 或 cDNA 片段被克隆至目标载体后，就可以采用相同的实验流程了。

在基因组文库制备中，首先从目标生物体、组织或细胞中提取出 gDNA。然后，对提取的 gDNA 进行酶切、分离并连接到具有兼容末端的目标载体中。使用具有常用酶切位点的限制性内切酶时，经常会发生基因组的部分酶切，这会导致定位克隆插入片段之间出现序列重叠（图5）。

gDNA文库的载体选择是一个重要的考虑因素，因为用于文库构建的基因片段通常很大（如，>20 kb）。克隆载体的选择也决定了将携带插入片段的载体递送到宿主中的方法（表 1） [1]。

连接产物或重组DNA可以通过转化被直接引入细菌细胞，或通过包装到噬菌体中并感染或“转导”至宿主细胞中（图 6）。在下游实验中，转化或转导细胞可用于存档、扩增和测序。在 2000 年初期，使用这种基础方法就已确定了许多生物体的全基因组序列，包括第一个全基因组序列 [2]。

在 cDNA 文库制备过程中，首先从生物体来源（如，细胞、组织等）提取出总 RNA，然后将 mRNA 逆转录成互补 DNA (cDNA)。该过程被称为第一链 cDNA 合成。随后，合成第二链并获得双链 cDNA。得到的双链片段可直接连接到平端克隆载体（随机克隆），或者可以使用酶切位点“标记”末端以进行定向克隆（图7）。

cDNA 文库能否良好、准确地代表表达基因组，取决于多种因素，包括来源 mRNA 群体的质量和完整性。在逆转录步骤中，逆转录酶能否从混合和复杂组分（包括长 RNA 模板和稀有 RNA 转录物）中合成 cDNA 对于获得足够的文库覆盖度来说也是至关重要的（参见逆转录酶选择）。使用图7总结的基本方法，许多 cDNA 文库制备可用于构建综合数据库，例如哺乳动物基因库 (MGC)——由NIH发起的最大的哺乳动物（包括人类、小鼠和大鼠）cDNA克隆文库。

什么是逆转录？

在 10 分钟内完成逆转录

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在文库构建之后，目标之一是通过对插入片段测序来鉴定克隆。这些文库代表的插入片段大小通常为 25kb 到 300kb 具体取决于载体类型和目标生物体的基因组大小 [1]。Sanger 测序曾是使用最广泛的 DNA 测序方法，在读数质量良好的测序反应中，其测序上限通常小于 1kb。为克服这一问题，研究人员转向使用鸟枪法克隆和测序。在该方法中，较大的克隆插入片段经过物理或酶解方法进一步断裂，并被亚克隆到另一个载体中；随后，对小克隆片段进行测序。之后，利用生物信息学程序根据序列重叠（称为连续的或“重叠群”）将这些序列重新组装，最终获得原始长序列（图8）。

鸟枪法测序有助于病毒、细菌和人类等许多生物体的全基因组测序。该方法可用于基因组从头测序，并且能通过验证reads和缺口补充来提高已测序基因组的质量。在人类基因组的首次测序期间，由政府资助的人类基因组计划即是对已被克隆到细菌人工染色体或 BAC 载体中的大基因片段进行了鸟枪法测序。在进行鸟枪法克隆之前，克隆片段的基因组位置应该已经确定，这样鸟枪序列组装更简单。因此，该方法被称为分级鸟枪法测序（图9A）。由于使用 BAC 克隆作为来源，该方法也被称为逐步克隆法测序 [3,4]。

另一个由 Craig Venter 领导的私人资助型全基因组测序项目与人类基因组计划同期进行，该项目直接对人类基因组 DNA（而不是已定位的克隆片段）使用了鸟枪法测序。因此，这一过程被称为全基因组鸟枪法测序（图9B）[5]。D理论上，鸟枪法测序不需要关于基因组或遗传图谱的已知信息，并且能够节省时间和资源。但是，具有参考遗传图谱对于序列组装过程中是很有帮助的，因为全基因组鸟枪法测序需要大量的计算能力，特别是对于具有大型基因组的生物体。遗传图谱或指纹识别常使用限制性内切酶 [4]，如 RFLP 和 AFLP 方法。

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