乙醇及其代谢物在人体内的代谢动力学研究

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作者：

光永立

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摘要：

目的: 1,建立人体血液及尿液中乙基葡萄糖醛酸苷(EtG)和乙基硫酸酯(EtS)的提取及高效液相色谱串联质谱(HPLC/MS/MS)检测方法; 2,研究乙醇及其代谢物在人体内的代谢动力学规律,建立乙醇的代谢动力学模型,方程和参数. 3,研究乙醇及其代谢物与饮酒时间之间的关系,建立饮酒时间的推断方法;根据widmark方程推断饮酒剂量的分配系数和方法. 方法: 1,受试者:中国太原地区志愿者28名,男女各半,年龄22-27岁.所有受试者均无酗酒史,无心,肝,肺,肾脏病史及其它慢性疾病,且在受试前两周内未饮酒,未服任何药物.受试者均已签署知情同意书. 2,标本采集:受试者以0.72克乙醇/公斤体重为计量单位,在30分钟内,伴食饮用相应体积的中国白酒(乙醇浓度40%),分别在饮酒前及饮酒后0.5,1.5,2,3,5,8,12,24,36,48,120小时采集肘静脉血5ml,在饮酒前及饮酒后0.5,1.5,2,3,4,5,6,8,12,15,24,36,48,120小时采集尿液适量,-20℃冰箱保存待检. 3,提取检测 乙醇检测: 根据本课题组前期研究方法,取血样或尿样1 mL置于顶空瓶中,加入87 mg/mL的叔丁醇内标物1 mL,再加入3mL水进行稀释,混匀后密封,进行顶空-气相色谱分析. EtG,EtS检测: 血液:取血液100μL,加入100μL混合内标(1μg/mL,甲醇,EtG-D5,EtS-D5)及800μL甲醇/乙腈(1/5,v/v)混合液,涡旋混合1min.0℃下静置10min后离心5min(13000r/min).取上清800μL,35℃空气吹干.使用400μL水/乙腈混合液(95/5,v/v)溶解,离心后取3μL上清,经过HPLC/MS/MS进行分析测定. 尿液:100μL尿液中加入100μL混合内标(2μg/mL,甲醇,EtG-D5,EtS-D5)和800μL甲醇/乙腈(1/5,v/v),涡旋混合1min.0℃下静置10min,将离心5min(13000r/min).取上清800μL,40℃空气吹干,400μL水/乙腈混合液(95/5,v/v)溶解,离心后取上清3μL,经过HPLC/MS/MS进行分析测定. 4,数据处理方法:WinNonlin药代动力学软件;SPSS13.0统计软件;采用 t检验和方差分析. 结果: 1.样本检测: 1.1乙醇检测:根据本实验室刘晓霞建立的测定乙醇的分析方法对人血液和尿液中的乙醇进行检测.其回收率为95%~99%,最低定量限(LOQ)为10mg/100mL,最低检测限(LOD)为5mg/100mL,线性范围10~600mg/100mL,相关系数0.99. 1.2 EtG,EtS检测: 血液:该方法可满足对于血液中乙醇代谢物的检测.EtG绝对回收率为66.1~70.1%,基质效应在11.5~15.4%之间; EtS绝对回收率为82.0~88.6%,基本没有基质效应.日内精密度为2.5~4.7%,日间精密度2.0~6.1%;最低检出限为0.02μg/mL,最低定量限为0.05μg/mL.线性范围在0.05~5μg/mL.相关系数r值均在0.999以上. 尿液:该方法可满足对于尿液中乙醇代谢物的检测.EtG绝对回收率为50.4~57.5%,基质效应26.8~36.4%;EtS绝对回收率为102.9~110.1%,基质效应-24.3~-6.0%;二者线性范围均为0.2~20μg/mL,相关系数r值均在0.999以上;最低检出限为0.1μg/mL,最低定量线为0.2μg/mL. 2.乙醇的代谢动力学 2.1血样中乙醇,EtG和EtS均有明显的变化规律.其中,乙醇的变化规律性更为明显,而EtG与EtS则比较一致.血液中乙醇的最高浓度为23.8~65.6 mg/100mL,达峰时间为0.5~3.0h;EtG的最高浓度为0.134~0.525μg/mL,达峰时间为2.0~5.0 h.EtS的最高浓度为0.077~0.254μg/mL,达峰时间为1.5~4.0 h.血液中EtG与EtS的达峰时间比乙醇滞后;而EtG与EtS相比,EtG的达峰时间更长. 2.2尿液中乙醇,EtG和EtS的变化规律不明显.乙醇的最高浓度为15.5~50.4 mg/100mL,最长检测时间为3.0~8.0h;EtG的最高浓度为18.4~393.0μg/mL,最长检测时间为15~48h.EtS的最高浓度为6.4~90.8μg/mL,最长检测时间为12~48h.研究发现EtG与EtS的检测时限具有明显的个体差异性.尿液中EtG与EtS于达峰后很快下降,总体检测时限也均比乙醇本体要长,而EtG的检测时限比EtS更长. 2.3乙醇原体在血液和尿液中的药物动力学过程符合一级吸收一室开放模型,乙醇原体在血液中吸收相半衰期和消除相半衰期分别为1.19±0.45h和1.16±0.30h;乙醇原体在尿中的吸收半衰期和消除半衰期为1.10±0.38h和1.10±0.38h;其代谢物EtG在血液和尿液中吸收半衰期分别为2.02±0.39h和2.53±0.84h,消除半衰期分别为2.05±0.30h和2.60±0.82h;其代谢物 EtS在血液和尿液中吸收半衰期分别为1.95±0.36h和1.83±0.88h,消除半衰期分别为1.95±0.36h和2.35±1.37h. 2.4乙醇在血液中的消除速率为10.88±5.18mg/100ml/h;乙醇在尿液中的消除速率为16.24±5.54 mg/100ml/h. 3.饮酒时间以及饮酒剂量的推断 3.1饮酒时间推断 采用BAC/EtS和 UAC/EtG拟合方程推断饮酒时间.相关性较好,误差大部分小于20%. 3.2饮酒剂量推断 根据Widmark公式对饮酒剂量进行初步推断,本次研究所得到的分布常数r为1.14±0.31,与报道的0.75～0.80不同.通过反推的理论饮酒剂量误差小于20%. 结论: 1,本研究建立了人体血液及尿液中EtG和EtS的提取及高效液相色谱串联质谱(HPLC/MS/MS)检测方法; 2,本研究建立了乙醇及其代谢物在人体内的代谢动力学研究模型,研究了乙醇及其代谢物在人体内的代谢动力学,为乙醇中毒的诊断或者相关法医学鉴定提供依据. 3,本实验初步建立了乙醇饮酒时间以及饮酒剂量的推断方法,为乙醇中毒(死亡)案件法医学鉴定中饮酒时间和饮酒剂量的推断提供实验依据.

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关键词：

乙醇 代谢物 人体内

学位级别：

硕士

学位年度：

2016

DOI：

10.7666/d.D01089747