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【推荐】病原体快速分子诊断,尿液快检一步到位!

2023-05-18 20:08| 来源: 网络整理| 查看: 265

 尿液检测 

由于尿液易采集、易诊断,是临床上用于诊断尿路感染(UTI)和性病(STD)的理想样本类型。

在上个月美国圣地亚哥举行的Tri-Con展会上,迈迪安展示了使用尿液直扩qPCR/LAMP预混液对人体尿液直接检测,用于替代通过细菌培养的传统方法法快速获得结果,降低成本的研究结果。 

尿液检测的方法学比较

传统的基于细菌培养的方法需要长达3天的时间来确定导致感染的微生物病原体。标准的qPCR方法可以在5小时内得到结果,但需要耗时耗力的核酸提取步骤。尿液直扩检测则可以直接从尿液中检测病原体,大大减少了检测的周转时间和成本。

研究中使用的迈迪安Urine-specific尿液特异性qPCR/LAMP预混液,可兼容冻干或风干,无需提纯核酸,适用于POC检测的理想选择。尿液直扩qPCR/RT-qPCR预混液可以对40%人体尿液直接进行检测,同时灵敏度可以达到1个拷贝/反应。尿液直扩LAMP/RT-LAMP预混液可以在短短20分钟内直接从尿液中检测到1个拷贝的病原体靶标。

数据还显示,这个配方可以用于对尿液样本直接检测虫媒传播的热带疾病(如寨卡、登革热等),在未来的POC诊断中具有很大的潜力 。

检测方法及材料 *尿液样本:本研究中使用的是性别未指明、未经过滤、5份人体尿液混合样本。 *qPCR / RT-qPCR反应:Lyo-Ready™可冻干尿液直扩qPCR/RT-qPCR预混液(MDX152/153)与引物探针一起冻干后密封常温储存。在进行反应时直接使用尿液样本复溶混匀后在以下条件下进行qPCR:qPCR: 95°C, 3分钟; 95°C 10秒,65°C 25秒, 45次循环RT-qPCR: 50°C, 10分钟; 95°C 2分钟; 95°C 10秒,65°C 30秒,45次循环对比试剂:ToughMix PCR Master Mix (QuantaBio) KAPA Probe Force qPCR Mix(Roche) Reliance One-Step Multiplex RT-qPCR Supermix™(Bio-Rad)TaqPath™ProAmp™Multiplex Master Mix (ThermoFisher)均为液体体系,按照各试剂推荐的浓度进行反应。 * LAMP/ RT-LAMP反应:Lyo-Ready™可冻干尿液直扩LAMP/RT-LAMP预混液(MDX154/155)™ 与引物探针一起冻干后密封常温储存。在进行反应时直接使用尿液样本复溶混匀后在以下条件下进行LAMP:LAMP/RT-LAMP循环: 65°C 60分钟。对比试剂:WamStart®LAMP Kit (NEB)SuperScript™IV RT-LAMP Master Mix (ThermoFisher)

均为液体体系, 按照各试剂推荐的浓度进行反应。 

qPCR尿路感染多重检测

图1:尿路感染的四重检测。分别使用冻干的Lyo-Ready™可冻干尿液直扩qPCR预混液(MDX152)、Quantabio、Roche和Thermo Fisher的对比试剂对40%混合人体尿液直接进行四重qPCR扩增,检测出4种病原菌(大肠杆菌、肺炎克雷伯菌、奇异变形杆菌和腐生葡萄球菌)。

MDX152对尿液样本直接四重检测中具有最早的Ct值和最高的荧光值,是可靠的多重尿路感染检测的理想选择。

 

qPCR性传染病高灵敏检测

图2:使用尿液样本直接进行性病多重检测。A)分别使用冻干的Lyo-Ready™可冻干尿液直扩qPCR预混液(MDX152)、Quantabio、Bio-Rad和Thermo Fisher的对比试剂对40%混合人体尿液直接进行四重qPCR扩增,检测4种性病病原体(生殖支原体、梅毒、沙眼衣原体和淋球菌)。B)分别使用以上四种预混液对10%人体混合尿液中10倍稀释的梅毒DNA进行扩增(1000、100、10和1拷贝/反应)。

MDX152对尿液样本直接四重检测中具有最早的Ct值和最高的荧光值。尿液直扩qPCR预混液具有最佳的多重扩增能力,可直接从尿液样本中检测低至1个拷贝DNA的试剂,是可靠的多重尿路感染检测的理想选择。

 

RT-qPCR虫媒传染病高灵敏检测

图3: 对尿液样本中4种蚊媒感染病原体的直接多重检测。

A)分别使用冻干的Lyo-Ready™可冻干尿液直扩RT-qPCR预混液(MDX153)、Quantabio、Bio-Rad和Thermo Fisher的对比试剂对20%混合人体尿液直接进行四重qPCR扩增,检测种虫媒病毒(登革热、寨卡和基孔肯雅热)和1种原生动物寄生虫(疟疾)。

B)分别使用以上四种预混液对5%人体混合尿液中10倍稀释的寨卡RNA进行扩增(1000、100、10和1拷贝/反应)。

MDX153在所有四种靶标的扩增显示出最早的Ct和最高的荧光值。数据显示,尿液直扩RT-qPCR预混液具有最佳的多重扩增能力,并且能够从尿液样本中直接检测低至1个拷贝的RNA靶标,是用于灵敏的热带传染病POC检测的理想选择。

LAMP性病快速灵敏检测

图4: 快速、灵敏的性病检测。A)分别使用冻干的Lyo-Ready™可冻干尿液直扩LAMP预混液(MDX154)、NEB和Thermo Fisher的对比试剂对40%混合人体尿液中的几种性病病原体(淋球菌、钩端螺旋体、生殖支原体、阴道毛滴虫和单纯疱疹病毒1型)直接进行LAMP扩增。误差条表示四个技术重复之间的标准偏差。B)使用上述试剂对20%混合人体尿液样本中10倍梯度稀释的阴道毛滴虫DNA进行直接LAMP扩增(1000、100、10和1拷贝/反应)。误差条表示四个技术重复之间的标准偏差。

检测对比显示MDX154对几种性病病原体具有最快速和最灵敏的直接扩增, TTR值最早,且NTC最迟(特异性也最高),是用于快速尿路感染和性病检测的理想选择。

 

RT-LAMP虫媒传染病高灵敏检测

图5:快速检测虫媒传染病。分别使用使用冻干的Lyo-Ready™可冻干尿液直扩RT-LAMP预混液(MDX155)、NEB和Thermo Fisher的对比试剂对20%混合人体尿液中的基孔肯雅热(CHIKV),丙型肝炎(HCV),西部尼罗病毒(WNV)、寨卡病毒(ZIKV)或黄热病(YFV)进行直接LAMP扩增。误差条表示三个技术重复的标准偏差。

MDX155对尿液样本直接LAMP检测中最快,且特异性最强,是用于热带传染病POC快速检测的理想选择。 总结 Urine-specific尿液直扩qPCR/LAMP预混液可以直接从尿液样本或提取的样本中检测到1个拷贝的目标DNA和RNA。 

尿液直扩qPCR预混液可以从尿液粗样或尿液提取的核酸样本中同时检测多个病原体,适用于多病原体传染病的检测。

 

尿液直扩LAMP预混液可以从尿液粗样或尿液提取的核酸样本中进行快速(



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