病毒去除稳健性工艺

引言：国际上保证产品病毒安全性的主要原则是基于美国、欧盟和日本人用药品注册协调大会标准（ICH Q5A），该指南文件建议用3种互补的方法来保证病毒安全性（1）筛选和检测用于制备产品的细胞系和其他原材料，确保所有进入细胞培养罐的物质：包括细胞、细胞培养基和添加成分没有病毒污染（2）在细胞培养结束时进行病毒检测，保证在细胞培养过程中没有任何病毒污染（3）纯化工艺清除病毒验证，证明纯化工艺能清除已知病毒。本文将着重于除病毒过滤在病毒清除方面的介绍。

图1 病毒及蛋白分子大小分布

病毒清除用对数减少值（LRV）来表达，是初始原液中的病毒总量与经过病毒清除步骤处理后病毒总量的比值，通常以对数值表达。相关法规要求每106剂量要小于1粒病毒颗粒，以证明制造过程的病毒安全性。对于来源于小鼠细胞系的生物产品，如中国仓鼠卵巢细胞（CHO）和寡核苷酸（NSO），这通常转化为约12-18log10内源性逆转录病毒的清除率和6log10外源性病毒的清除率。

病毒清除研究的目的是评价纯化过程中每一个工艺步骤灭活和清除病毒的能力，以及估算整个纯化工艺整体的病毒清除水平。通常病毒清除研究需要添加模型病毒，因为在实际生产过程中并没有外源病毒污染，所以纯化工艺清除病毒的能力无法在生产规模的细胞培养和纯化过程中来研究，而需要在小规模纯化工艺中加入模型病毒。模型病毒的选择是根据（ICH Q5A）的原则，即在上市申请时选择3个以上在大小、基因组、有无囊膜、物理化学处理抵抗力等特性方面差异较大的模型病毒（表1）。

表1 模型病毒

在上市批准时，需要依据ICH Q5A进行全面验证，而对Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ期临床试验产品可采用比ICH Q5A简化的验证，临床试验产品和上市产品病毒清除验证的不同要求见表2。

表2 法规上病毒验证的要求

病毒清除研究采用模拟生产工艺，即按比例缩，小规模工艺的方法。缩小规模工艺使用有代表性的来自大规模实际生产工艺中的产品，使用相同滤膜，而且在工艺参数设置点和范围都与大规模实际工艺保持一致（图2，过滤实验装置图）。优化过程中需要关注：流速和压力；料液处理量与膜面积的关系；流速衰减；产品回收率和质量等方面。

图2 除病毒过滤器实验装置

除病毒过滤是被证实能够显著去除病毒的步骤，其去除作用基于除病毒过滤的位置、料液浓度、料液的纯度情况、过滤压力、载量等。

6.1.除病毒过滤的位置

除病毒过滤过程可以在下游纯化的任意位置，但是通常设置在低pH病毒灭活后，中间层析步骤或者最终的层析步骤之后。总的来说，在整个下游过程中，由于蛋白质浓度、纯度和工艺体积可能不同，实际的过滤要求高度依赖于病毒过滤步骤所在的过程中的位置。

6.2.进料液的蛋白浓度

上样的蛋白浓度将通过料液与膜包的相互作用而影响除病毒过滤的通量，较高的蛋白浓度将降低除病毒过滤过程的速率，当然这也跟蛋白本身的性质和膜本身的性质有关。通常在产品不断稀释的过程降低产品浓度，来提高除病毒过滤膜包的载量和流速。

6.3.放置时间与冻存的影响

一些蛋白呈现出时间依赖性的聚体的倾向，尤其会在冻存过程产生聚体。因此，如果生产过程中存在长时间的hold或者需要冷冻时需要评估这两个方面。即使实际生产过程不会存在freeze–thaw步骤，但是small scale的病毒实验时以冷冻状态存储，所以也要考察这方面的性质。

6.4.压力释放

除病毒过滤的过程一般要保证连续过滤，压力中断可能导致病毒穿透的风险，其原理是：料液流经滤器的对流作用导致病毒颗粒由于分子大小的排阻被截留在膜表面或困于较小的孔径中，而当压力下降，流速也随之降低，对流作用减小，病毒会从小空隙中逃逸释放，并大概率扩散到大孔隙而穿透。图3研究了不论在高压还是低压下，压力中断都导致了病毒从过滤膜的前端向后端穿透。

图3 病毒过滤过程中压力中断图（左图）和病毒穿透电镜图（右图）

6.5.堵塞条件

滤器堵塞位点首先发生在尺寸相对较小的空隙，导致滤膜平均孔径增加，增加了病毒从大孔径穿透的概率。

6.6.极高的病毒添加量

除病毒滤器的病毒穿透的几率随着病毒的添加量的增加而增加的风险。

市面上比较常用的是Merck，Asahi-Kasei的产品。近年由于新冠疫情的影响，供应链都受到较大的挑战，很多大的制药公司也将目光转到比较出色的国产厂家，例如科百特。科百特主要为全球生命科学和工业领域的客户提供多元化服务，为客户提供先进的解决方案，帮助他们探索、研发和生产生物制品、疫苗、细胞治疗和通用药品。从实验室规模到中试规模在到生产规模，科百特都为客户提供比较完善的整体解决方案。同时，科百特工程师已经支持两家客户在不同第三方的验证实验室完成了两个重组蛋白项目的BLA申报验证。科百特全资子公司杭州纽创生物检测有限公司已经支持8家国内领先生物制药公司的10个项目的膜过滤病毒清除工艺有效性研究，加速客户项目的研发申报进度。

图4 科百特实验室规模到生产规模的滤器产品

7.1 科百特除病毒过滤膜种类

PES膜材质

科百特Viruclear VF采用连续梯度结构PES膜（图5），大幅度提高纳污空间，对于聚体等大颗粒工艺杂质具有较强的截留能力，下游由20nm精度的滤膜组成，渐变孔径，可以实现对于细小病毒的稳健截留能力，更好的应对压力中断等极端过滤测试挑战。Viruclear VF除病毒过滤膜采用高亲水性配方，有效的提高了PES膜的亲水性，对于高浓度、较疏水物料的过滤具有更高的通量和载量。同时Viruclear VF 除病毒过滤器可实现稳健的线性工艺放大，可在线进行完整性测试。

图5 Cobetter PES 除病毒过滤器精密截留层孔径分布曲线

PVDF膜材质

聚醚砜除病毒过滤器拥有较快的过滤速度和更高的产品通量，兼具高病毒的清除能力和稳健的容污能力，为不同规模的抗体生产提供持续经济适用性。但是，对于某些制品，如血制品、生化制品可谓“见血封喉”，往往达不到理想效果。反观PVDF填补了PES材质的缺陷，Viruclear VF  PVDF 除病毒过滤器对于高浓度、较疏水的料液过滤具有更高的通量和载量，对于较小的无包膜病毒具有极高的清除效率，并可在压力中断时提供极高的病毒截留。

图6 Viruclear VF PVDF 除病毒过滤器过滤表现

7.2.科百特除病毒过滤过滤器的工艺表现

7.2.1.压力中断

压力中断作为出病毒过滤的worst case之一，也是病毒清除验证中常被挑战的工艺条件。科百特滤器Viruclear VF，显示过滤过程工艺中断两次和过滤完成切换缓冲液顶洗的过程对模型病毒的去除能力仍达到4log以上。

7.2.2 膜包堵塞

滤器堵塞位点首先发生在尺寸相对较小的空隙，导致滤膜平均孔径增加，增加了病毒从大孔径穿透的概率。科百特滤器Viruclear VF，显示稳健的病毒截留能力，几个对比试验中模式病毒的去除能力仍达到6log以上。

7.2.3 压力的影响

长时间高压可能增加对滤器物理结构的负荷，而低压被认为是除病毒过滤的worst case。科百特滤器Viruclear VF，显示稳健的病毒截留能力，不论低压还是高压，模式病毒的去除能力均可达到6log以上。

除压力驱动外还有蠕动泵的驱动，蠕动泵产生的压力波动，可能潜在的影响除病毒滤器的病毒截留性能。下图显示，压力脉动对于Viruclear VF 除病毒滤器没有影响，病毒去除能力达到7.2log。

7.2.4.病毒高载

除病毒滤器的病毒穿透的几率随着病毒的添加量的增加而增加的风险。科百特滤器Viruclear VF，显示稳健的病毒截留能力，在极高的添加病毒量的去除能力仍达到6log。

病毒安全性的定义是模糊的，零风险是一个神话，这依赖于稳健的工艺设计和风险管控。以科百特为代表的国内的新兴企业将自主研发，为全球生命科学和工业领域的客户提供先进的病毒控制解决方案，帮助他们探索、研发和生产生物制品、疫苗、细胞治疗和通用药品。