文献综述：单细胞测序技术在传染病及微生物领域的应用研究进展

1.3 鉴定感染相关的免疫信号通路

单细胞转录组测序不仅能了解各种免疫细胞亚群的数目和具体的某项分子特征，更是转录组层面的全方位刻画，对于每个细胞而言，均可以知道其中所有信号通路的基因表达情况。因而单细胞测序不仅可以用于鉴定感染相关的免疫细胞亚型，还可以精细区分各类免疫细胞中感染引发的信号通路变化差异。通过单细胞测序，研究者们发现COVID-19激活了单核细胞等特定的免疫细胞亚群中的炎症和细胞因子相关的信号通路。这提示研究者未来可以从遏制炎症和细胞因子相关信号通路的角度来治疗COVID-19。正如血液肿瘤临床试验评价中的应用，单细胞测序也被用于评估疫苗接种后的体液免疫反应，了解疫苗对各种B细胞亚型的分子层面的影响。流感疫苗接种后只激活一部分外周记忆B细胞，并差异化调控了这部分激活的记忆B细胞中与宿主防御流感病毒相关的信号通路[10]。详细了解感染相关的细胞异质性免疫信号通路将加深我们对整个感染过程的分子免疫变化的理解，并有助于为处于不同感染阶段的患者开发治疗方法。

1.4 检测炎症反应的变化

炎症因子主要由受刺激的免疫细胞分泌，具有多种生物学功能，包括调节先天和适应性免疫反应、募集免疫细胞等。监测炎症反应的变化并确定感染后的关键炎症因子对于了解传染性疾病的发病机理及开发新的治疗策略必不可少。对感染者特定组织(如外周血、呼吸道黏液)的单细胞测序使我们能够理清大量产生的炎症因子来源于何种免疫细胞，从而找到抗炎治疗中的潜在药物靶标。最近，一项截至目前最大规模的COVID-19单细胞测序研究发现，COVID-19重症患者体内的大量炎症性细胞因子主要来源于外周血中的单核细胞和巨核细胞，以单核细胞为主，这些炎症性细胞中的S100A8/A9系统性上调可能导致了细胞因子风暴。另一项单细胞转录组测序研究发现，新型冠状病毒感染诱导产生的炎症因子促进了棒状细胞分泌粘蛋白，可能导致了急性呼吸窘迫综合征。这些研究表明，应用单细胞测序技术有助于研究感染过程中炎症因子水平的变化，揭示重要的分子致病机制。

1.5 传染病的生物标志物发现

目前已发现的各种传染病的生物标志物十分有限，而新兴的单细胞测序技术极大地方便了疾病相关生物标志物的鉴定。例如，登革热患者发病前，其外周血中的幼稚B细胞的MX2、CD14+CD16+单核细胞的CD163和IFIT1均已显著上调，因此这些表达水平显著改变的基因有潜力成为预测登革热疾病的生物标志物。Cai等通过单细胞测序发现，CD3−CD7+GZMB+NK细胞亚群可以作为识别活动性结核病患者和监测治疗反应的一种新的生物标记。在现今传染病研究中，将单细胞转录组测序用于监测与特定感染相关的基因表达模式，可以发现更多感染性疾病诊断和预后的候选生物标志物。

微生物研究领域传统的测序方法以16S核糖体核糖核酸(ribosomal ribonucleic acid，rRNA)基因特征区域测序和宏基因组测序为主，前者主要用于鉴定菌落和量化菌群丰度，后者除能实现前者功能外还可以量化菌群中的主要信号通路表达水平。但是两种传统方法都强烈依赖已知的微生物遗传信息，无法对自然界中不易培养的微生物进行测序和研究。近年来，随着细菌单细胞测序技术的开发，研究者突破了微生物单个个体RNA含量低及缺少通用扩增识别片段[如真核细胞信使RNA (message RNA，mRNA)的poly-A片段]的技术局限，拥有了更多、更精细化的手段来研究细菌、真菌等人体密切相关微生物。区别于宏基因组研究，单细胞测序无需对微生物的已有知识就可以对单个微生物进行测序分析，进而发现新的微生物物种、构建新的微生物进化树、获取新的微生物基因组序列，加深研究者对微生物生命活动过程的理解，尤其是对包括病原微生物和人体共生菌群在内的人体相关微生物的发现和认知有助于研究人员、医护工作者更深层次地认识各种涉及微生物的疾病的致病规律和分子机制。

2.1 获取难以培养微生物的遗传信息

目前地球上大约99%的细菌不能够在实验室实现人工培养，采用单细胞测序为发现尚不能培养的微生物提供了可能。使用结合荧光激活细胞分选技术的单细胞测序可以发现并鉴定引起慢性牙周炎的TM7门细菌，这类细菌尚无法培养。Pamp等对哺乳动物肠道共生菌分节丝状菌进行了单细胞全基因组测序，为该菌与宿主的互作研究提供了思路。

2.2 检测未知的病原微生物和耐药菌株

通过对致病性微生物和宿主细胞的基因组学和转录组学研究，可以更清楚地了解微生物的分子进化机制和病毒感染的动力学，有助于检测和鉴定新的微生物物种。Combe对水泡性口炎病毒感染的90个细胞的881个病毒斑进行测序，发现单个感染单元内存在多个有遗传差异的病毒基因组，意味着多种病毒共存网络对疾病发挥作用。此外，一些日渐兴起的超灵敏的单细胞测序新技术使得研究者能够快速检测各种病毒突变体，同时也可用于挖掘抗病毒药物耐受相关基因。

2.3 剖析微生物种群异质性

细胞异质性在原核生物和真核生物中普遍存在，通过对微生物群落的单细胞转录组分析也有助于了解微生物群落的异质性。微生物构成的群落随着外界环境改变而不断发生着变化。研究表明，即使是相同环境条件的微生物群落，在RNA组成方面通常也是异质的。

人体不断暴露于各种微生物中，人体细胞与各种共生或致病病原体之间不断发生着多种相互作用。这一相互作用一方面作用于宿主的免疫系统，另一方面影响微生物的存活繁殖，因此，理解人体内各种微生物与宿主的相互作用对于了解人体微生态的正常生理过程和传染性疾病发病机制有着重要意义。转录组测序是不受已有知识和预先假设限制来研究微生物-宿主分子网络联系的重要工具。不同于普通人体细胞的转录组测序，涉及人体微生物的测序研究需要解决的一大难题是区分微生物和宿主的RNA。目前针对人体微生物-宿主相互作用的研究已发展出一些专门的转录组测序技术，主要包括宏转录组、双重RNA测序(同时测病原体和感染的宿主细胞)、三重RNA测序(同时测两种功能类型的微生物和宿主细胞)、宿主单细胞测序、病原体单细胞测序、生态位测序等。其中，单细胞转录组测序从单个细胞、细菌层面分析感染的病理生理学，探究宿主细胞对病原的表现及出现不同易感性的原因，完善了对传染性疾病感染到发病机制的理解。

一方面，单细胞测序在挖掘病原体感染的靶细胞特征、探索易感性的分子学特征方面具有独特的优势。Golumbeanu等用单细胞转录组测序表明，HIV潜伏后疾病是否发作及易感性取决于HIV病毒感染的CD4+T细胞亚群的转录特征。Zanini等对登革热患者的单细胞转录组测序则发现了登革热疾病发作之前B细胞及单核细胞的转录组变化特征。这些免疫细胞的转录组变化可能是病原体-宿主相互作用的后果，而后决定了感染性疾病的进展方向。在研究新型冠状病毒的靶细胞表面受体特征方面，研究者通过对患者组织的单细胞测序发现了TMPRSS2、ANPEP、DPP4、ENPEP等膜蛋白与严重急性呼吸综合征冠状病毒2 (severe acute respiratory syndrome coronavirus 2，SARS-CoV-2)的棘突蛋白的受体ACE2共表达，可能协助病毒入侵。

另一方面，单细胞测序还可以用于评估各类细胞中潜伏病毒的遗传物质含量，有助于确定病毒的宿主细胞。最近一项大规模COVID-19的单细胞测序研究发现，SARS-CoV-2病毒的RNA主要存在于巨噬细胞、中性粒细胞、T细胞、NK细胞等免疫细胞及少部分纤毛上皮细胞和鳞状上皮细胞中，而且以巨噬细胞和中性粒细胞为主，病毒负载量大。这一发现暗示承担了先天性固有免疫功能的免疫细胞可能是与SARS-CoV-2病毒互作的主要宿主细胞。

从微生物角度而言，针对人体内特定组织部位菌群的单细胞转录组测序能够帮助我们研究这些病原微生物在人体内的活动和功能，更接近病原体-宿主交互作用的真实环境，减少体外培养环境带来的潜在人为误差。

利用单细胞测序技术不仅可以检测未知的病原微生物，还可以监测到耐药株的出现、跟踪病原体的抗性，从而进行传染病的诊断和机制研究。目前的单细胞测序绝大多数集中于转录组层面，仅能反映RNA水平，未来随着新技术的发展，结合基因组、表观修饰组、蛋白质组、宏基因组、宏转录组等多组学技术的综合研究将使得我们能够更加全面地分析单个细胞或微生物的功能，系统地阐明各种感染性疾病的致病机制。单细胞测序相关技术未来将更广泛地应用于各种感染性疾病和微生物领域研究，助力开发更好的诊断和预后生物标志物，辅助设计更准确的靶向抗感染疗法，以提高传染病治疗效果并避免耐药性。

文献来源

陈碧清, 刘细细, 朱学军. 单细胞测序技术在传染病及微生物领域的应用研究进展[J]. 微生物学通报, 2022, 49(11): 4886-4892.返回搜狐，查看更多