磷酸化修饰：蛋白磷酸化的发现及功能解析

首先，复习一下最简单的概念：蛋白质的磷酸化修饰（Phosphorylation modification），通常是指在酶的催化作用下，将ATP的磷酸根基团，转移到蛋白的氨基酸侧链上，ATP随之变为ADP。该过程通常是可逆的，催化磷酸化修饰发生的酶，被称为激酶（kinase），去除蛋白磷酸化修饰的酶，被称为磷酸酶（phosphatase）。磷酸化修饰被称为蛋白质的功能“开关”，可以借此调控蛋白的活性。

▼

关于磷酸化发现的趣事

1883年，德国化学家Olof Hammarsten首次发现，作为乳汁中最主要的组成成分，酪蛋白（casein）除了含有五种已知的化学元素外（C, N, O, H and S），还有磷元素。这是人类历史上第一次发现磷酸化蛋白的存在。

直到1954年，Eugene Kennedy发现大鼠肝脏的匀浆物，能够将ATP的磷酸转移到酪蛋白上，其首次定义了激酶（“proteinphospho kinase”）。

遗憾的是，EugeneKennedy一直对自己的发现比较疑惑：为什么肝脏中的蛋白能够将奶乳汁中的蛋白磷酸化？两者似乎毫无关系啊。因此， Eugene Kennedy后来并未继续开展磷酸化修饰相关的工作，转而投向了脂质的研究。多年以后，当人们开始了解到磷酸化修饰如此重要的生物意义，并不断取得重大进展时，Eugene Kennedy遗憾地回忆到：“I dropped thestudy of protein kinases and, like the base Indian, cast a pearl away, elsericher than all his tribe!’”

1992年，Fischerand Krebs因为揭示磷酸化修饰是主要的生物调控机制，而分享了当年的诺贝尔奖。

 ▼

磷酸化修饰——无处不在

磷酸化修饰是目前已知分布最为广泛的翻译后修饰。据估计，真核生物中有将近1/3的蛋白，能够在任何时候被磷酸化。

目前，人类细胞中已证实的激酶有518种，而植物拟南芥与水稻中被预测分别有1000种和1467种激酶。（虽然目前人类样本中的磷酸化研究的成果最为丰富，但是从激酶数量上来看，植物样本的磷酸化功能可能更为复杂多样，好比未被开垦的处女地。）

磷酸化蛋白和位点的数据，据预测有1-2 million个。在实际的研究中，借助于质谱技术，哺乳动物的磷酸化修饰数据量的鉴定记录，为62,679phosphosites on 11,632 proteins，来自于《Nature》上刊登的一篇乳腺癌组织的磷酸化蛋白质组分析。植物中最多的磷酸化数量的报道，为60,366phosphosites on 8141 proteins，来自于多个研究的数据整理。从这些实际检测到的数据来看，磷酸化修饰的数量远超我们的预知。

▼

磷酸化修饰——无所不能

在生物领域，大自然反复强调的一个真理是：存在即有功能，更何况磷酸化修饰是如此丰富的存在。磷酸化修饰，可以说是无所不能。难怪Dr Dewi Brennig James曾在1997年的一篇《Nature》发文中，感叹到："The chemistry of Phosphorus is the chemistry of life, sorry Carbon"。

我们通过大量的文献调研，对目前所知的磷酸化修饰对生物过程的调控作用，做了一个概括，大致可归类为以下几个方面：

1. 调控细胞膜功能：

主要是指磷酸化调控细胞膜上各种蛋白的功能，主要有两种方式：

（1）目标蛋白发生磷酸化修饰，直接改变蛋白活性。受调控的膜蛋白主要包括：受体（如细胞因子受体、植物激素受体、神经递质受体、植物RLKs等）、离子通道（如Potassium channels、Calcium channels）、转运体（如神经递质转运体SERT与DAT、植物PIN‐FORMED(PIN) auxin efflux carriers）、水通道（Aquaporin）、细胞连接通道（Connexins），等等。

IUBMB Life. 2015 Jul;67(7):524-32.

（2）调控这些膜蛋白的内吞过程。蛋白被磷酸化修饰后，会触发其被内吞，那么在膜上发挥功能的蛋白的含量就减少了，从而间接调控膜蛋白功能。

Journalof Integrative Plant Biology 2013, 55 (9): 789–808

2.  调控细胞内信号转导：

这是磷酸化修饰最为熟知的功能，内容非常繁杂，概括起来主要包括，但不限于：

※ 营养和代谢感知信号：包括细胞所需的氨基酸、糖等营养物质的监视和代偿处理的信号机制，以维持细胞功能所需的营养供应和代谢平衡维持：

Trends EndocrinolMetab. 2015 Dec;26(12):676-87

※ 免疫模式识别受体信号（pattern-recognition receptors (PRRs）：动物和植物的免疫系统对“异物”的识别后，磷酸化修饰负责后续的信号转导，最终引发对“异物”的处置，如TLR受体家族信号通路：

Immunity. 2016 Jul 19;45(1):15-30

※ 细胞因子受体信号：细胞因子是细胞外信息传递、细胞间交流和细胞自我调控的主要物质，可广泛参与各种细胞行为的调控。主要包括生长因子、趋化因子、白介素家族等。很多受体的胞内域本身具有激酶活性，或能够招募激酶。胞外的细胞因子与受体的胞外域结合后，会引起受体胞内域的磷酸化修饰，进而通过一系列的磷酸化信号转导，最终引发蛋白转录、细胞生长、迁移、死亡等多种行为的应答。以生长因子类信号通路为例：

※ 植物激素信号：包括ABA, cytokinin, BR, auxin, gibberellicacid, jasmonic acid, kinetin等激素，在细胞内的信号转导均可由相应的激酶介导。因此，磷酸化信号转导是调控植物生理、胁迫应激的关键过程。以ABA与cytokin信号通路为例：

Enzymes.2014;35:27-56； Nature Chemical Biology 5,301–307 (2009)

※ 干细胞增殖与分化信号：比如大家检测Wnt/ß-catenin, Notch, Hedgehog等干细胞增殖、分化相关通路的活性时，一般都是检测这些蛋白的磷酸化水平的表达变化。以Wnt/ß-catenin通路为例：

※ 神经活动相关的信号转导：如神经递质受体NMDA receptor、AChR，以及ion chanel与transpoters，这些蛋白的下游往往会通过第二信使如Ca2+、cAMP引发激酶的激活。另外，神经营养因子受体NT receptor也是通过磷酸化修饰进行转导，过程参考细胞因子信号。因此，磷酸化在神经生理方面发挥重要作用。

Neural Regen Res. 2013 Mar25;8(9):843-52.

※ 生物节律信号：2017年诺贝尔奖成果也与磷酸化修饰密切相关，例如哺乳动物昼夜节律的关键调控者之一就是casein kinase I (CKIε)：

NatRev Mol Cell Biol. 2007 Feb;8(2):139-48.

※ 应激相关信号转导：生物细胞内具有一整套机制来监视内外环境的变化，以便迅速做出反应，因此磷酸化修饰成为一种重要的调控机制。磷酸化修饰参与oxidative stress 、DNA damage、temperature与osmotic stress等各种应激反应。细胞通过相关机制感知到应激情况后，会通过激酶将信号专递出去，引起效应蛋白的功能改变，继而迅速应对环境的变化。以DNA损伤应激、温度胁迫与氧化应激的响应通路为例：

Cell Cycle. 2010 Sep1;9(17):3479-84.； TrendsPlant Sci. 2007 Oct;12(10):444-51. ；Int J Mol Sci. 2015Oct 23;16(10):25234-63.

3.    转录调控：

转录过程的启动，最经典的过程就是：胞浆内的转录因子激活，然后进入细胞核，在各种转录相关蛋白的帮助下，转录因子与DNA启动子结合，最后与转录复合物蛋白一起启动转录和蛋白翻译过程。实际上，上述的整个过程目前发现都与磷酸化修饰的调控有关（因此，磷酸化修饰变化往往先于蛋白表达变化，这就是为什么磷酸化修饰通常取样的处理时间比较早），具体过程大致如下：

※ 第一步：磷酸化修饰可通过直接或间接的方式，调控转录因子的活化，使其转位进入细胞核：

（1）直接激活转录因子：转录因子往往处于信号通路转导的下游，是很多信号通路转导的终点之一。很多转录因子可通过磷酸化修饰形式而转为激活状态，然后进入细胞核与DNA约会（如STAT等）。

（2）修饰转录因子和/或转录共调节蛋白，从而招募或抑制两者的相互作用。例如，NF-kB在非激活状态下处于被kIB抑制的状态，磷酸化可通过改变kIB的抑制作用，而间接释放转录因子活性。相反CREB与CREB-binding protein (CBP)结合则是直接通过磷酸化修饰介导的。

（3）调控转录因子降解：很多转录因子的特定位点被磷酸化修饰后，会导致转录因子被泛素连接酶所识别，进而通过泛素化降解机制来实现转录活性的抑制。如大名鼎鼎的p53 tumor suppressor就是通过磷酸化进行激活和降解双向调控。这也是，磷酸化稀释与泛素化修饰主要的cross-talk形式。

※ 第二步：转录因子进入细胞核后，磷酸化修饰通过调控染色质结构，为转录复合物与DNA结合提供条件：

（1）磷酸化修饰可调控SWI/SNFremodeling complex活性，进而调控核小体的重构

（2）磷酸化可直接修饰组蛋白，进而参与组蛋白对染色质结构的影响。已知的组蛋白磷酸化修饰位点以及功能，如下：

Cold SpringHarb Symp Quant Biol. 2010;75:23-6.

（3）磷酸化调控组蛋白甲基化酶、去甲基化酶和相关效应蛋白的活性，间接调控基因信息的“读写”和“擦除”。通过这种方式，磷酸化修饰参与基因表观调控。已知的表观相关蛋白的磷酸化修饰如下：

Prog BiophysMol Biol. 2015 Jul;118(1-2):8-13.

※ 第三步：磷酸化修饰调控转录复合物与DNA启动子的结合，启动DNA转录过程：

（1）转录因子发生磷酸化修饰后，会影响转录因子的电荷性质变化，从而影响其与DNA的直接结合能力。

（2）磷酸化修饰可调控基础转录复合物的活性：如磷酸化可修饰RNA polymerase II， general transcriptionfactors (GEFs)等，使相关蛋白协同发挥转录作用

4. 磷酸化调控线粒体功能与能量代谢：

※ 磷酸化调控线粒体功能：很多研究已经证实，线粒体中存在多种激酶如PKA、Akt、MAPK、Abl、SRC等。通过这些激酶，线粒体的多种生物过程都存在磷酸化修饰的参与：

（1）参与线粒体DNA维持、转录和翻译（TFAM、CREB、ComplexI-V的磷酸化修饰）

（2）调控TCA循环（Aconitase hydratase、Citrate synthase的磷酸化修饰）

（3）调控Carbohydratemetabolism（Glycerol-3-phosphate dehydrogenase、Hexokinases 1 & 2、PDH的磷酸化修饰）

（3）参与氨基酸代谢（branchedchain dehydrogenase (BCDH) 的磷酸化修饰）

（4）调控Mitochondrialdynamics（Drp1、Miro、Parkin的磷酸化修饰）

（5）调控线粒体相关凋亡（BAD、BCL-xL、MPTP的磷酸化修饰）

（6）调控自噬（Parkin的磷酸化修饰）

Experimental Gerontology 56 (2014) 202–220

※ 磷酸化修饰调控代谢过程：生物酶是代谢过程的掌控者。而磷酸化修饰是代谢酶活性调控的重要开关之一（另一个主要开关是酰化修饰）。大多数胞浆及线粒体内的代谢酶均具磷酸化修饰。以葡萄糖代谢途径为例，每个代谢流程上负责的代谢酶几乎都具有磷酸化修饰的形式：

Oncogene (2014) 33, 4279–4285

5. 磷酸化修饰调控细胞骨架：

细胞骨架是细胞的基本结构单元，不仅决定着细胞的形态和细胞器的有序分布，还是细胞移动、增殖分裂、物质运输、分泌、神经轴突生长等过程的主要参与者。磷酸化修饰对细胞骨架的调控主要体现在：

※ 细胞骨架调控相关的信号转导过程，为磷酸化形式，包括：CDC42/Rac/PAK, Rho/ROCK,FAK, LIMK, CaMK, Cortactin, WASP等。一般大家研究细胞骨架调控的信号变化，检测的都是这些蛋白的磷酸化水平。

※ 磷酸化修饰可调控细胞骨架结合蛋白的活性，影响其对细胞骨架的调节：如cofilin, VASP, Arp2/3等

※ 磷酸化修饰直接调控细胞骨架蛋白以及粘附斑蛋白的基本结构单元：如actin、tubulin 、myosin、vimentin、Paxillin、vinculin等的磷酸化，最终影响微丝、微管等的聚合、解聚和结构等。

6. 单细胞生物：

※ 对于单核细胞而言，翻译后修饰更为重要。因为这些细胞直接暴露于环境中，通过翻译后修饰这种快速响应的机制，能够保证其对环境变化做出快速反应。因此，单细胞生物常常利用磷酸化修饰来不断调整其代谢策略，保证其对环境的适应能力。

※ 此外，越来越多的研究发现，磷酸化对于病原微生物对宿主的感染能力至关重要。很多证据表明，具有致病性的病原菌比非致病性的致病菌拥有更多的酪氨酸磷酸化修饰。相关的机制包括：磷酸化修饰调控细菌表面多糖的合成，调控真菌菌丝、荚膜生长等，调控病原微生物的增殖、成熟、侵入和对宿主免疫系统的影响，等等。

▼

总结

磷酸化修饰可以广泛调控细胞的生物功能，包括细胞膜、细胞骨架、信号转导、转录翻译、代谢等生物过程。上述的内容，只是我们为大家总结的磷酸化修饰功能的一隅。几乎可以说，只要是蛋白质参与的生物过程，都有磷酸化修饰的参与（换句话说，同样的实验设计或生物表型，除了研究蛋白质表达以外，完全可以从磷酸化修饰的角度进行切入研究）。因此，磷酸化已经逐渐成为各个领域的研究热点，如动、植物的生长发育，肿瘤、心血管等各类疾病，生物免疫、神经系统功能、植物胁迫，等等。虽然，目前对磷酸化修饰的作用，已经有了整体的概念。但是，对于某个具体生物过程中，有哪些蛋白通过磷酸化修饰形式参与？某个具体的蛋白是如何发生磷酸化修饰的？磷酸化修饰具体发挥了怎样的功能作用？目前学术界了解的还是及其有限的，值得大家开展广泛的探索和深入研究。

最后本期的内容以本文中提到的两句名言结尾（经过本期的介绍，也许大家对着两句名言有了更深入的理解）：