酵母杂交实验常见问题

问1：酵母单杂交的实验原理是什么？

答：酵母单杂交技术是由酵母双杂交GAL4系统衍生发展而来，是一种在酵母细胞内分析与鉴定转录因子与DNA顺式作用元件相互结合的有效方法。简单来说，将已知特定顺式元件构建到最基本启动子（minimal promoter, Pmin）的上游，报告基因连接在启动子下游，构成包含target DNA Element(bait sequence)的诱饵DNA。将转录因子构建到可以表达AD激活结构域的载体上，表达形成融合猎物蛋白（prey）。如果顺式作用元件和转录因子结合，会激活Pmin启动子，从而促使报告基因。因此，可以通过检测报告基因表达与否来判断顺式作用元件与转录因子是否发生互作。

问2：诱饵DNA有什么要求？

答：诱饵DNA一般会选择顺式作用元件或者启动子序列。顺式作用元件作为诱饵时尽量使用短的顺式作用元件（一般＜20 bp），串联重复2-3次作为诱饵DNA；如果顺式作用元件超过100 bp，使用1个拷贝即可。启动子序列作为诱饵时不要包含TATA box。如果启动子序列小于100 bp，使用2个拷贝作为诱饵。如果超过100 bp，使用1个拷贝作为诱饵。

问3：什么是顺式作用元件？

答：顺式作用元件（cis-acting element)是存在于基因旁侧序列中，能影响基因表达的一段DNA序列，其作用是参与调控基因表达；顺式作用元件本身不编码任何蛋白质，仅仅提供一个作用位点，要与反式作用因子（多是转录因子）相互作用才能起作用。

问4：常用的最基本启动子有哪些，其对应的下游报告基因是什么？

答： 有3种常用的最基本启动子，分别为pHis2载体的PminHIS3启动子，报告基因为HIS3；pLacZ载体的PCYC1启动子，报告基因为LacZ；pAbAi载体的iso-1-cytochrome C启动子，报告基因为AbAr。

问5：单杂系统常用质粒和菌种有哪些？

答：常用质粒有pHis2、pABAi、pLacZi、pGADT7、pGADT7-REC、pB42AD等，除pLacZi外均为穿梭质粒，同时包含大肠杆菌和酵母菌的复制起始位点，并含有不同的抗性以及氨基酸缺陷型筛选标记。pGADT7-Rec和pGADT7二者功能相同，但为了方便文库转化，前者插入了特定的可以与文库发生同源重组的序列。pB42AD和pGADT7载体相似，都带有GAL4转录因子的激活结构域序列。

常用菌种有Y1HGold、Y187、EGY48、YM4271等，其中EGY48与YM4271互为伴侣菌株，可以mating。根据实验方案选择合适的酵母菌及对应的载体。

问6：筛选标记和报告基因的作用及检测方法是什么？

答：质粒的组成元件包括复制起始位点、抗性基因、多克隆位点、启动子、引物结合位点、筛选标记等。酵母单杂实验中，选择的质粒的筛选标记多为氨基酸缺陷型标记。用对应的缺陷型培养基筛选可以确定质粒是否成功转入受体酵母菌。

酵母双杂中往往有多个报告基因可以同时检测，但是单杂中的报告基因一般只有一个。通过对应筛选条件检测该报告基因是否表达，可以判断Pmin是否激活，从而判断顺式作用元件是否和转录因子互作。如HIS3报告基因为用HIS缺陷型的培养基检测，LacZ报告基用X-gal显色缺陷型培养基（SD/-Trp/-Ura/Gal/Raf/X-Gal）检测，AbAr报告基用加入了AbA的缺陷型培养基检测。

问7：常用的酵母单杂系统有哪些？

答：常用的酵母单杂系统有Y1Hgold（pABAi+pGADT7 / pGADT7-REC），Y187（pHis2+pGADT7 / pGADT7-REC），EGY48（pLacZi+pB42AD）。三种单杂体系未发现有明显的优劣之分。

问8：三个酵母单杂系统主要区别？

答：

1）pAbAi-Bait（DNA）+pGADT7rec或者pGADT7；Y1HGold菌株。插入目的DNA的pAbAi载体需要线性化后转到Y1HGold菌株，制成Bait菌株；筛选标记AbA；

2）pHIS2-Bait（DNA）+pGADT7；Y187菌株。Bait不需要整合到酵母基因组，不需要线性化；筛选标记His+3-AT。

3）pLacZi-Bait（DNA）+pB42AD；EGY48菌株。Bait载体需要线性化整合到酵母基因组；筛选标记X-gal。

问9：pAbAi-bait线性化的内切酶如何选择？

答：pAbAi-bait线性化时候选择BstBl或者BbsI均可，不可使用其它内切酶。

问10：pAbAi-bait酶切后如何判断是否线性化成功？

答：单酶切产物进行琼脂糖凝胶电泳，以未酶切的质粒以及DNA Marker做对照。完全酶切成功的载体只有一条带，与未酶切的质粒相比涌动速度慢一些，与DNA Marker相比泳动速度和等长度的Marker片段近似。

问11：pAbAi-bait酶切产物胶回收效率太低如何解决？

答：酶切产物回收标准流程为：跑大孔胶→切胶→溶胶→结合→洗涤→洗脱。此方法得到的酶切产物纯度高，但是回收率低。酶切后取少量电泳检测已酶切完全（只有一条带），无需跑胶→切胶→溶胶，直接进行结合→洗涤→洗脱步骤，可有效减少损耗。建议酶切载体加入量1 μg以上。

问12：pAbAi空载可以作为诱饵阴性对照使用吗？

问13：线性化载体和环状载体转化效率和PCR鉴定有什么区别？

答：线性化载体转化效率低，转化效率＜102/μg质粒；环状载体转化效率高，一般转化效率＞104/μg质粒。如果进行PCR鉴定，线性化载体转化成功之后，是以基因组做模板，而环状载体以质粒做模板。

问14：线性化载体和环状载体后续培养基的选择有什么区别？

答：线性化载体转化成功后重组在基因组为稳定遗传，环状载体转化成功后为独立复制单元。所以后续扩繁、保菌、制备感受态等实验，线性化载体可以用YPDA培养基，而环状载体必须用相应的筛选培养基，否则环状载体会随着复制而逐渐丢失。

问15：酵母单杂交的主要用途有哪些？

答：验证已知DNA与蛋白之间是否存在相互作用；分离结合于目的顺式调控元件或其它短DNA结合位点蛋白的新基因；定位已经证实的具有相互作用的DNA结合蛋白的DNA结合结构域，以及准确定位与DNA结合的核苷酸序列。

酵母单杂自激活检测相关知识问答

以Y1Hgold（pAbAi-bait）和Y187（pHis2-bait）为例

问1：酵母单杂交为什么要检测自激活？

答：Pmin启动子自身会导致下游的报告基因有本底表达，而且克隆到载体的顺式作用元件有可能会与酵母内源性转录因子结合，所以说自激活是个普遍存在的现象。只有在没有内源性转录因子可以与顺式作用元件结合或者结合能力非常弱的前提下，报告基因的本底表达才可以被抑制，单杂实验才可以继续。

问2：诱饵存在自激活怎么办？

答：pAbAi-bait存在自激活，需要设置梯度浓度AbA的SD/-Ura平板培养；pHis2-bait存在自激活，需要设置梯度浓度3-AT（SL0930）的SD/-His/-Trp平板培养，进一步检测自激活的强度。

问3：Y1Hgold（pAbAi-bait）自激活检测的主要实验步骤？

答：

1）质粒线性化：构建pAbAi-bait质粒→提取质粒→酶切质粒→线性化质粒回收；

2）制备Y1Hgold感受态细胞：YPDA平板活化→YPDA液体扩繁→制备酵母感受态细胞；或者直接购买Y1Hgold感受态细胞（CC308）；

3）转化：pAbAi-bait转化Y1Hgold感受态细胞；

4）筛选：SD/-Ura平板（PM2272）28-30℃培养3天左右；

5）鉴定：PCR鉴定顺式作用元件是否正确插入（SK2422）；

6）扩繁：阳性克隆YPDA扩繁；

7）检测：SD/-Ura+AbA平板（CA2332）检测bait是否有自激活。

问4：Y187（pHis2-bait）自激活检测的主要实验步骤？

答：

1）准备质粒：构建pHis2-bait质粒→提取质粒；

2）制备Y187感受态细胞：YPDA平板活化→YPDA液体扩繁→制备酵母感受态细胞；或者直接购买Y187感受态细胞（CC306）；

3）转化：pHis2-bait转化Y187感受态细胞；

4）筛选：SD/-Trp平板（PM2252）28-30℃培养3天左右；

5）鉴定：PCR鉴定顺式作用元件是否正确插入（SK2420）；

6）扩繁：阳性克隆SD/-Trp扩繁；

7）检测：SD/-His/-Trp平板（PM2282）检测bait是否有自激活。

问5：AbA的浓度梯度怎么设置？

答：AbA的初筛浓度建议设置0、50、100、200 ng/mL。根据初筛诱饵菌落生长情况，再设置下一轮的AbA浓度梯度。例如诱饵菌落可以在50 ng/mL的培养基生长而不能在100 ng/mL的筛选培养基生长，可以选择100 ng/mL作为后续AbA的使用浓度，或者在50-100 ng/mL之间设置梯度再进行筛选。又例如诱饵菌落在200 ng/mL的培养基上有生长但是弱于0 ng/mL的培养基，可以设置250、300、350、400 ng/mL的AbA做进一步筛选；而诱饵菌落在200 ng/mL和0 ng/mL的培养基上生长无任何区别，可以设置400、600、800 ng/mL做进一步筛选。理论上AbA的浓度不应超过1000 ng/mL。

问6：3-AT的浓度梯度怎么设置？

答：3-AT的初筛浓度建议设置0、2.5、5、10 mM。根据初筛诱饵菌落生长情况，再设置下一轮的3-AT浓度梯度。例如诱饵菌落可以在0 mM的培养基生长而不能在2.5 mM的筛选培养基生长，可以选择2.5 mM作为后续3-AT的使用浓度。又例如诱饵菌落在10 mM的培养基上有生长但是弱于0 mM的培养基，可以设置15、20、25、30 mM的3-AT做进一步筛选；而诱饵菌落在10 mM和0 mM的培养基上生长无任何区别，可以设置20、30、50 mM做进一步筛选。理论上3-AT的浓度不应超过80 mM。

问7：怎么计算AbA的加入量？

答：AbA（CA2332）为浓度为1 mg/mL的母液，配制200 ng/mL的AbA的培养基，每100 mL的培养基加入20 μL；如果配制平板（20 mL培养基倒1块平板），计算方法为20 mL×200 ng/mL÷（1000×1000 ng/mL）=4 μL，即每20 mL培养基加入4 μL。

问8：怎么计算3-AT的加入量？

答：3-AT（SL0930）为浓度2.5 M的母液，配制10 mM的3-AT的培养基，每100 mL的培养基加入400 μL；如果配制平板（20 mL培养基倒1块平板），计算方法为20 mL×10 mM÷2500 mM=80 μL，即每20 mL培养基加入80 μL。

问9：培养基温度降到多少℃时加入AbA或3-AT才合适？

答：配制固定浓度的AbA或者3-AT的培养基时，建议培养基灭菌后65℃水浴恒温后加入，摇匀后倒平板；配制梯度浓度AbA或者3-AT的培养基时，建议培养基灭菌后分装到无菌的50 mL离心管中，65℃水浴恒温后加入，摇匀后倒平板。既可以避免培养基温度过高造成AbA或3-AT降解，又可以避免温度过低培养基凝固过快。

问10：涂板或者点板时如何设定菌浓度？

答：涂板或者点板，生长出来的菌落为单菌落，无论菌落密集程度，只要平板菌落是单菌落的状态，不成片也不成团，那么该菌浓度在合理范围，重复实验的筛选浓度也以此为准。涂板时，建议菌浓度为OD=0.002，直径9 cm的培养皿涂布100 μL；点板时，控制初始菌浓度OD值0.1-0.5之间，常设0.2，按十倍梯度再稀释3个浓度，每个浓度点10 μL。AbA或者3-AT的有效浓度只以OD值0.0002的菌浓度的筛选结果为准，此浓度菌在不含筛选性的平板上，理论上可以得到20个单菌落。

问11：如果出现自激活无法抑制情况怎么办？

答：

1）首先核对菌落涂布方法。实验者容易忽视涂板或者点板的菌浓度对自激活抑制结果的影响，其实菌浓度是造成自激活抑制结果不一致的主要原因。类似于对人体的抗生素用药，应该根据体重确定用药剂量，同样道理同一浓度的AbA或者3-AT对于不同数量菌的抑制效果也不一样。

2）核对自激活体系是否正确。建议选用pAbAi-P53做对照，已知pAbAi-P53存在自激活，而且100-200 ng/mL的AbA可以抑制其自激活现象。如不能抑制，则说明筛选培养基配制错误。

3）当AbA浓度达到1000 ng/mL，或3-AT浓度达到80 mM，诱饵自激活还是无法抑制，那说明插入的Bait自激活过强，无法进行筛库以及验证实验。需要重新构建Bait。

问12：互作验证实验，有推荐的快速自激活检测方案吗？

答：互作验证实验，推荐自激活和互作实验同时进行，可以最大程度推进实验进度，并获得可靠的结论。

Y187（pHis2+pGADT7 / pGADT7-REC）推荐方案为：

1）pHis2-bait和AD-prey质粒混合作为实验组，将pHis2-bait和空载AD质粒混合作为自激活组。将实验组和自激活组分别共转到Y187感受态细胞中。

2）用SD/-Leu/-Trp（PM2222）平板筛选转化子，并将转化子用SD/-Leu-Trp液体培养基扩繁。

3）菌液稀释多个梯度，SD/-His/-Leu/-Trp（PM2152）+梯度浓度的3-AT的培养基平板上点板，同时点SD/-Leu-Trp平板做对照。

4）分析结果。SD/-Leu/-Trp平板自激活组和实验组菌落生长无区别，如果某个浓度的3-AT的SD/-His/-Leu/-Trp培养基自激活组不长而实验组长，说明实验组互作成立；如果3-AT浓度梯度范围内自激活组和实验组都不能生长，说明实验组不互作；如果最高浓度的3-AT自激活组和实验组同时生长，说明自激活太强，无法判断互作是否成立。

Y1Hgold（pABAi+pGADT7 / pGADT7-REC）推荐方案为：

1）pABAi-bait转入Y1Hgold感受态细胞中。并将其制备成Y1Hgold（pABAi-bait）感受态细胞。

2）将AD-prey质粒作为实验组，将空载AD质粒作为自激活组，分别转入Y1Hgold（pABAi-bait）感受态细胞中。

3）用SD/-Leu（PM2202）平板筛选转化子，并将转化子用SD/-Leu液体培养基扩繁。

4）菌液稀释多个梯度，梯度浓度的AbA的SD/-Leu培养基平板上点板，同时点SD/-Leu平板做对照。

5）分析结果。SD/-Leu平板自激活组和实验组菌落生长无区别，如果某个浓度的AbA的SD/-Leu培养基自激活组不长而实验组长，说明实验组互作成立；如果AbA浓度梯度范围内自激活组和实验组都不能生长，说明实验组不互作；如果最高浓度的AbA自激活组和实验组同时生长，说明自激活太强，无法判断互作是否成立。

◆ 酵母杂交实验常见问题——双杂知识及自激活检测篇

◆ 酵母杂交实验常见问题——酵母转化篇

◆ 酵母杂交实验常见问题——筛选培养基篇

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