NGS建库方法，NGS接头引物，都看过来！

2023-08-13 23:50| 来源: 网络整理| 查看: 265

二代测序，又称为高通量测序，是一个强大的功能平台，它可以同时给数以万计的DNA分子进行测序。由于这种可以多个样本同时测序的能力，在个性化医疗、遗传疾病和临床诊断等方面，二代测序开创了革命性的领域。虽然不同的二代测序仪器生产时会在技术细节上有许多不同，但它们都有以下几个步骤：文库构建、上机测序、数据输出。

自2003年人类基因组计划完成之后，测序技术发展迅猛，多种测序原理产品在市场上出现。经过科研人员的不断开发和改进，目前成熟的第二代测序技术有3种，分别为Roche公司的454技术、ABI公司的SOLiD技术和Illumina公司的Solexa技术。不同的二代测序平台的区别主要体现在测序反应的技术上，这些差别可以分为4类： 1. 焦磷酸测序在焦磷酸测序技术中，每个核苷酸结合过程中释放的焦磷酸在参与了一系列化学反应后会产生荧光，通过检测每次荧光信号，从而读出待测序列。这项技术能够读取的长度已经可以与一代测序法得到的读长相当，平均为400bp。但也存在缺点，即测序会引入插入和缺失。 2. 合成法测序合成测序法目前已被Illumina NGS平台使用。首先，在Flowcell中加入荧光标记的dNTP和酶，以引物为起始点合成子序列。合成完每个碱基后会洗去多余的dNTP和酶，并扫描荧光信号来读取碱基，过程重复直至测序完成，从而获得待测序列。 3. 连接测序法连接测序技术用16种8nt的Oligo核苷酸探针来结合核苷酸，每个探针的5’端都分别吸附了四种不同的荧光染料。每种8nt的oligo包含2个特异碱基和6个退化碱基。测序反应开始时，引物先结合到待测序列上，再和相应的探针结合，然后仪器开始检测荧光信号并记录。一个循环结束之后，需要切掉荧光信号和探针的最后3个碱基，再开始下一个循环。这项技术产生的测序读长很短，所以一般很少使用。 4. 离子半导体测序离子半导体测序技术在测序反应中通过释放氢离子来检测一个基因簇的序列。每个基因簇直接固定在一个半导体三极管上，在核苷酸结合过程中，氢离子被释放到溶液中，这个半导体三极管可以通过检测溶液pH的改变来读取序列。文库构建 DNA文库构建是二代测序建库技术的基础。DNA建库方法是分子生物学的实验原理，其本质就是在待测片段两端加上接头的过程，按照接头连接方式不同，现有的DNA建库方法可分为五类： 1. TA克隆连接接头建库 TA克隆连接接头建库是目前应用最广泛的建库技术，其步骤为：先将提取好的DNA样品片段化，再对片段化的DNA进行末端修复并加A尾，然后连接上接头（adapter），最后通过PCR扩增放大样品浓度。此项技术中，我们需要提前合成好带T尾接头和末端带A的目的片段，并且在DNA连接酶的作用下通过TA克隆方式将其和片段化样品连接。

TA克隆连接接头建库流程 2. Swift法建库 Swift建库方法是Swift BioSciences公司独有的建库技术，其步骤与TA克隆连接接头建库方法较相似，需要在待测片段两端引入P5和P7接头序列。同样的，在末端修复之后，先在3‘端连接P7接头，然后在5‘端连接P5接头，最后通过PCR扩增提高样本浓度。

Swift法建库流程 3. 转座酶法建库转座酶法建库技术的关键是Tn5转座子，Tn5转座子是一种细菌转座子，本质是一段含有若干抗性基因和编辑转座酶基因的DNA片段。传统的建库方式需要经过DNA片段化、末端修复、接头连接、文库扩增、多步纯化等步骤，将Tn5用于文库构建时，可将DNA片段化、末端修复、接头连接等多步反应转变为一步反应，缩短建库时间。 Tn5用于建库的体外转座要素包含：转座子的末端序列、靶DNA、转座酶（Tnp）和Mg2+（激活剂），转座法建库形成的文库结构如下：

转座法建库文库结构将P5、P7端部分接头序列（Adapter 1/2）和转座子末端序列结合，设计合成供体DNA，Tnp识别转座子末端形成带有P5、P7端部分接头的Tn5转座复合体。该复合体识别受体DNA的靶序列（Target site），切断受体DNA，并插入携带的供体DNA，形成一端带有P5部分接头Adapter 1，一端带有P7部分接头Adapter 2的DNA，之后通过PCR加上Barcode以及接头其余部分，形成含P5端与P7端完整接头的DNA文库。

转座酶法建库流程 4.PCR扩增子建库扩增子建库方法是利用PCR反应在待测片段两端加上接头，只需要两轮PCR和纯化就可以得到目标文库。其中第一步将含通用序列的引物和目标区域结合，第二步通过PCR反应连接测序接头。

扩增子建库流程与其它建库方法对比，扩增子建库通过定制引物Panel完成文库构建。扩增子建库方法具有临床应用性，可以针对疾病目标基因进行捕获，提高目标基因检测的覆盖度和测序深度，解释临床结果。相较于其他建库方法，扩增子方法建库可以通过单次测序反应检测更多患者样本，大大减少后期生信分析的任务，获得的数据更易于储存和管理。 5. 平末端连接接头建库平末端连接接头的方法与Illumina平台类似，也是在片段化好的DNA片段两端加上特定接头。同样，该方法包括以下步骤：DNA样本片段化、末端修复，连接adapter（PI和A/P1和X），选择性回收DNA片段，文库PCR富集，纯化PCR产物。与Illumina通过采集荧光信号记录碱基序列的方法不同，平末端连接接头建库的测序方法是通过微环境中pH值短暂的下降被pH电极检测并记录来完成数据读取的。

平末端接头连接建库流程（Ion Torrent平台）金唯智NGS引物在NGS文库构建和捕获测序过程中，需要使用大量高品质的引物和探针，确保高纯度、低交叉污染、均一定量等。金唯智拥有12年寡核苷酸合成经验，通过不断研发生产工艺，推出高品质NGS引物，类型如下：

服务优势：

NGS验证服务： NGS验证服务将Index引物构建文库，通过NGS验证，能有效计算每条Index引物的交叉污染率。依托金唯智丰富的NGS技术平台，可为客户提供额外NGS接头引物交叉污染率检测验证服务。其中，Index接头引物可以提供NGS验证报告，目前可提供MGI平台验证或是Illumina平台验证。

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