金黄色葡萄球菌AgrA/C双组分信号转导模型的构建与功能评价

金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)是一种极具危害性的人类病原菌，可引起皮肤、口腔以及鼻腔粘膜等组织局部化脓感染，也可引起肺炎、伪膜性肠炎、心包炎以及尿路感染等，若不及时治疗常引起败血症、脓毒症等全身感染导致死亡[1]。但近年来由于抗生素的过度和无序使用，金黄色葡萄球菌等多种人类致病细菌对多种抗生素产生了严重的抗药性，给疾病防治带来了严峻的挑战，如何控制超级细菌已成为全球医疗领域的难题[2]。因此，开发抗菌药物的新方法、新手段及寻求新药物靶点已成为医药领域关注的焦点和迫切需要。

金黄色葡萄球菌在侵染宿主过程中产生溶血素、杀白细胞毒素、表皮溶解毒素、肠毒素等多种毒力因子，这些毒力因子是其致病的主要原因。毒力因子的表达受到细胞内不同调节系统的控制，同时这些调节系统之间也存在着复杂的相互作用关系[3]。研究表明，金黄色葡萄球菌毒力因子的表达主要由附属基因调节(Accessory gene regulator，agr)系统调控。agr系统是一个全局调控因子，受群体感应(Quorum sensing，QS)机制调节，也是典型的双组分信号转导系统。agr系统包含2个启动子P2和P3，RNAII是启动子P2的效应器，RNAIII是启动子P3的效应器。RNAII包含AgrB、AgrD、AgrC和AgrA 4个开放阅读框，AgrD是信号分子自诱导肽(Autoinducingpeptides，AIPs)的前体，经膜蛋白AgrB加工后，形成有活性的AIP分泌到胞外。AgrC是一种跨膜受体组氨酸蛋白激酶，与反应调节因子AgrA组成一个双组分信号转导系统(Two component signal transduction system，TCSTS)。AgrC是组氨酸蛋白激酶大家族中的一类，负责接收胞外AIP信号的刺激，调节菌体自身各种生化反应和细胞行为。当外界环境中的AIP浓度达到一个阈值，AgrC发生依赖于ATP的自我磷酸化，并将磷酸基团转移至反应调节因子AgrA，从而激活AgrA，激活后的AgrA可以与P2-P3之间的DNA区域特异性结合，从而调节效应器RNAII和RNAIII的转录与表达[4-6]。

传统的抗生素通过干扰细胞壁的合成、损伤细胞膜、抑制关键蛋白和DNA的合成而直接杀死病原菌细胞。这种“生与死”的选择压力极大地加速了微生物耐药性的进化，随着抗生素的大规模使用，很多病原菌对抗生素产生了很强的耐药性。以AgrA/C双组分信号系统为靶点开发的信号转导抑制剂则能够阻断与微生物致病性和耐药性相关的信号转导通路，从而降低病原微生物的感染。由于信号转导抑制剂不影响病原菌的生长能力，不易产生耐药性，是现代新型抗菌药物创新开发的前沿方向。从药物化学角度来看，靶向金黄色葡萄球菌AgrA/C双组分信号系统的抑制剂可分为4类：(1) AIP竞争性抑制剂，可与AgrC胞外域结合，从而阻断信号通路；(2) AgrC激酶抑制剂，可与AgrC胞内域结合，从而阻断信号通路；(3) AgrA-DNA相互作用抑制剂；(4) RNAIII表达抑制剂[7-8]。其中，AIP抑制剂由于能够从源头上阻断信号通路，被视为最有前景的抑制剂，也是研究的热点，Blackwell等合成了多种AIP结构类似物。目前，检测这些化合物生物活性的方法是利用细胞内构建的报告基因来测定，无法直接证明化合物是否靶向AgrC蛋白，是否作用于其胞外域[9-10]。因此，急需构建一种简单、直接的药物筛选模型。若能在体外构建一个人工模拟AgrA/C双组分信号转导模型，将为在生物体外研究金黄色葡萄球菌双组分信号转导的机制，以及以其为靶点的药物筛选提供很大的便利。

本研究拟对AgrA和AgrC蛋白进行表达纯化及活性分析，进而利用脂质体介导法在体外组装AgrA/C双组分信号转导系统模型，并利用EMSA实验对其做出评价。该研究对于建立针对金黄色葡萄球菌的新型抗菌药物筛选平台具有重要意义。

金黄色葡萄球菌ATCC6538购自中国工业生物菌种保藏中心。

NB培养基(g/L)：蛋白胨10.00，牛肉膏3.00，氯化钠5.00，pH 7.4。

TBE培养基(g/L)：酵母提取物24.00，蛋白胨12.00，甘油4.00，MgSO4 0.24，KH2PO4 2.70，K2HPO4 18.20，pH 7.0。

32Y培养基(g/L)：酵母提取物32.00，蛋白胨8.00，氯化钠5.80，卡那霉素0.05，溶解在10 mol/L Tris-HCl (pH 7.6)缓冲液中。

携带pET-28a(+)-AgrC和pET-28a(+)-AgrA重组质粒的大肠杆菌(Escherichia coli) C43(DE3)由本实验室构建并保存。Luminescent Kinase Assay Kit购自Promega公司；HEPES [4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid]、ATP、DOPC (1, 2-Dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine)、DPPA (Diphenylphosphoryl azide)、LDAO (Lauryldimeth-ylamine oxide)、Cholesterol购自Avanti公司；IPTG (Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside)购自生工生物工程(上海)股份有限公司；蛋白酶抑制剂Pefabloc SC购自Roche公司；Bio-Beads™ SM-2 Resin购自Bio-Rad公司；Ni-SepharoseTM High Performance购自GE公司；AIP信号分子由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。层析柱HiLoadTM 16/600 SuperdexTM 200 pg购自GE公司；荧光发光微孔检测仪购自BioTek公司；高压细胞破碎仪购自广州聚能生物科技有限公司。

将携带pET-28a(+)-AgrA重组质粒的大肠杆菌接种至含有氯霉素和卡那霉素的TBE培养基中，37 ℃、220 r/min培养。待菌体密度达到OD600为0.5时，加入终浓度为0.5 mol/L的IPTG，20 ℃、222 r/min诱导表达22 h，4 ℃、8 000×g离心10 min收集菌体，并用PBS缓冲液(137 mmol/L NaCl，2.7 mmol/L KCl，10 mmol/L Na2HPO4，2 mmol/L KH2PO4，pH 7.4)洗涤菌体3次后再悬浮，使菌体最终密度达到100 mg/mL。向菌液中加入终浓度为1 mol/L MgCl2、20 mol/L咪唑、蛋白酶抑制剂(每片10 mL)和100 U/mL DNase，在冰上孵育1 h，在4 ℃、108 Pa压力下，用高压细胞破碎仪破碎菌体，然后24 000×g离心25 min，收集上清。应用金属离子亲和层析法(Immobilized metal affinity chromatography，IMAC)对蛋白粗提液进行纯化。将5 mL已处理好的填料(Ni-SepharoseTM High Performance)灌入低压层析柱(Bio-Rad，2.5 cm×10 cm)中，用Washing buffer (137 mmol/L NaCl，2.7 mmol/L KCl，10 mmol/L Na2HPO4，2 mmol/L KH2PO4，10%甘油，50 mmol/L咪唑，pH 7.4)平衡10 min，随后加入10 mL蛋白粗提液，4 ℃、200 r/min轻摇5 min，使目的蛋白与填料充分结合，利用4倍柱体积的Washing buffer对杂蛋白进行洗脱，洗去未结合的非特异性蛋白。最后用Elution buffer (137 mmol/L NaCl，2.7 mmol/L KCl，10 mmol/L Na2HPO4，2 mmol/L KH2PO4，10%甘油，500 mmol/L咪唑，pH 7.4)将目的蛋白洗脱出来。IMAC纯化后的目的蛋白再利用分子筛层析法(Size exclusion chromatography，SEC)进行纯化，所用层析柱为HiLoadTM 16/600 SuperdexTM 200 pg，流动相组成为：100 mmol/L NaCl，10%甘油(体积比)，10 mmol/L HEPES，pH 7.4。

将携带pET-28a(+)-AgrC质粒的E. coliC43(DE3)接种至含有卡那霉素的32Y培养基中，30 ℃、220 r/min培养，待菌体密度达到OD600为0.25-0.35时，加入终浓度为0.1 mol/L的IPTG，于20 ℃、220 r/min诱导表达24 h，4 ℃、8 000×g离心收集菌体，并用PBS缓冲液漂洗2次。每2.0 g湿菌体用10-15 mL PBS缓冲液重悬，并加入终浓度为20 mmol/L咪唑、1 mmol/L MgCl2、蛋白酶抑制剂(每片10 mL)、100 U/mL DNase，置于冰上孵育2 h。然后，在4 ℃、108 Pa压力下对菌体进行低温超高压破碎3次，于4 ℃、24 000×g离心20 min去除细胞碎片，得到的上清液在4 ℃、300 000×g超高速离心50 min得到细胞膜沉淀。将细胞膜沉淀用PBS缓冲液重悬，并加入20 mmol/L LDAO表面活性剂，冰上缓慢摇动(50 r/min)过夜，4 ℃、200 000×g离心1 h去除未溶解的细胞膜，得到目的蛋白粗提液。利用IMAC和SEC对目的蛋白进行纯化，具体方法同AgrA蛋白的纯化方法。

金黄色葡萄球菌的agr系统包含2个启动子P2和P3，P2和P3之间的序列包含4个AgrA的结合位点，据此人工合成了101 bp核心序列，序列见表 1。将合成的正义链与反义链以相同体积混合，将退火缓冲液(10×)加入到混合物中(终浓度为1×)，混和均匀，置于PCR仪进行退火反应：95 ℃、2 min；每8 s下降0.1 ℃退火至25 ℃；4 ℃ 30 min。反应结束后，稀释至1 μmol/L备用。

采用EMSA法检测AgrA蛋白活性，反应体系为10 μL。实验设置了6组实验，除了对照组6外，每组实验中加入等量的DNA，AgrA蛋白浓度为0.4-1.0 μg/μL，具体反应体系见表 2。配制6% PAGE凝胶，将配好的6%胶首先在0.5×TBE缓冲液中预电泳30 min。各反应液混匀，于室温孵育30 min，上样至6% PAGE凝胶孔中，65 V恒压电泳。电泳结束后，先用Gel-Red染色并在凝胶成像仪中观察拍照，然后通过考马斯亮蓝染色观察凝胶中蛋白条带。

利用Kinase-Glo Luminescent Kinase Assay试剂盒对AgrC激酶活性进行测定。具体方法参考文献[11]。

利用表面活性剂介导的方法将AgrC蛋白镶嵌至脂质体囊泡双层膜内，同时将信号分子AIP包埋在囊泡内。AgrC蛋白的镶嵌方法在文献[12]和[13]基础上进行了优化：将脂质体(DOPC:DPPA:Chol= 1:1:0.5，摩尔质量比)溶解至半溶解状态，然后以AgrC:Lipid=1:500和AIP:Lipid=1:100 (摩尔质量比)的比例分别加入AgrC和AIP，室温孵育45 min，用Bio-Beads™ SM-2 Resin吸附表面活性剂，3 000 r/min离心去除Bio-Beads™ SM-2 Resin树脂，将上清液在10 000 r/min转速下离心15 min，去除未包埋到脂质体囊泡内的AIP，蛋白脂质体再用HEPES缓冲液悬浮。

实验过程与AgrA蛋白活性的EMSA测定实验相似。反应体系为20 μL，设置了2组反应。第一组反应(1-4号)添加了AgrC蛋白脂质体及不同浓度的AgrA，具体反应体系为：AgrC proteoliposome with AIP (2 mmol/L) 10 μL，ATP (100 mmol/L) 4 μL，AgrA 2 μL，DNA (1 μmol/L) 2 μL，EMSA buffer 2 μL；第二组反应(5-8)添加了溶解于表面活性剂的AgrC及不同浓度的AgrA，具体反应体系为：AgrC (4 mmol/L) 5 μL，AIP (20 mmol/L) 5 μL，ATP (100 mmol/L) 4 μL，AgrA 2 μL，DNA (1 μmol/L) 2 μL，EMSA buffer 2 μL。各组反应在室温放置30 min，并在6% PAGE、65 V条件下电泳，利用Gel-Red染色电泳胶并在凝胶成像仪中观察拍照。

近年来，随着耐药性菌株的不断出现，agr系统作为新的药物靶点备受关注。由于还没有建立在体外快速、高通量筛选抑制剂的药物筛选模型，以agr信号转导通路为靶点的药物开发，尤其是针对AgrC和AgrA蛋白为靶点的抑制剂开发受到限制。本文设计了一种AgrA/C双组分信号转导模型，该模型不仅可用于抑制剂的筛选，具有可实现高通量、易检测、特异性强等优点，而且将为双组分系统中磷酸传递机制研究提供新的途径。采用的策略及具体操作思路如图 1所示：(1)以脂质体模拟细胞。脂质体囊泡内外提供亲水环境，脂质体二分子膜为信号受体蛋白AgrC提供类似天然的环境，使AgrC保持较高生物活性。(2)利用表面活性剂介导的方法将AgrC镶嵌至脂质体上。通过调整膜组成和脂质体溶解状态调控AgrC胞内域朝向囊泡外，同时将信号分子AIP包埋在囊泡内。(3)在该体系中加入底物ATP和AgrA即可构成AgrA/C双组分信号转导模型。在此模型中，AgrC接受AIP的信号刺激，发生其自身构象变化打开活性部位，在有底物ATP存在的情况下发生自我磷酸化转移，将磷酸基团转移至AgrA活化AgrA蛋白，活化的AgrA蛋白可与含有启动子P2-P3的DNA结合。

包含P2-P3核心序列的DNA复性后的琼脂糖凝胶电泳结果如图 2所示，复性后的DNA条带大小为101 bp，与理论大小一致，说明复性成功。

将重组质粒pET-28a(+)-AgrA和pET-28a(+)-AgrC分别在大肠杆菌C43(DE3)菌株中表达，菌体细胞经高压破碎后离心，利用IMAC和SEC纯化目的蛋白。由于AgrC蛋白是膜蛋白，因此在纯化过程中通过超高速离心收集镶嵌有目的蛋白的膜组分，并利用含有表面活性剂的缓冲液进行溶解，纯化后的蛋白电泳检测结果如图 3所示。AgrA和AgrC分别在26 kD和48 kD附近出现条带，分子量大小与理论结果相符，蛋白纯度达到90%以上，可用于后续实验。

agr系统具有2个启动子P2和P3，P2和P3之间的碱基序列中包含4个AgrA的结合位点，AgrA蛋白以二聚体的形式与DNA紧密结合，调控下游蛋白的表达。未被磷酸化的AgrA蛋白本身也能与DNA结合，即具有本底活性，当被磷酸化后其与DNA结合的能力将大幅度提高，从而调控下游基因的表达[14]。若将AgrA与包含P2-P3序列的DNA混合并反应，AgrA即可与DNA结合，其分子量变大，因此在聚丙烯酰胺凝胶电泳中发生条带迁移现象。

EMSA结果如图 4A所示，除了6号未加DNA外，其余实验组每组反应中均加入了等量的DNA，5号是未添加AgrA蛋白的对照组。从图 4A可知，对照组5号泳道中，在DNA标准分子量100 bp之处可看到明显的DNA条带；1-4泳道中，随着体系中AgrA浓度的增加，分子量大小为100 bp之处的DNA条带亮度逐渐减少，当AgrA浓度大于0.75 μg/μL时，分子量大小为100 bp之处DNA条带完全消失，DNA条带出现在离上样孔较近的地方，说明DNA结合在AgrA蛋白上。将图 4A的凝胶再用考马斯亮蓝染色，并观察AgrA蛋白在凝胶中的位置，结果如图 4B所示。图 4B中泳道1-6对应于图 4A中泳道1-6。当体系中只有AgrA蛋白而未加入DNA时，在离上样孔很近的地方有一条蛋白条带，即为AgrA。随着DNA浓度的增加，AgrA蛋白条带上方的蛋白条带浓度加深，参考图 4A中DNA条带位置，可认为这一条带是AgrA-DNA复合物。只有当所纯化出的AgrA蛋白有活性时，AgrA才能结合到DNA并发生延滞现象，因此可以得出如下结论：纯化得到的AgrA蛋白折叠正确，具有活性。

利用Kinase-Glo Luminescent Kinase Assay法测定了纯化得到的AgrC蛋白的激酶活性。测定过程中，分别按0、5、10和15 μg的浓度梯度将AgrC蛋白加入反应体系中。测定结果如图 5所示，随着蛋白量的增多，荧光强度梯度下降，表明体系中剩余的ATP逐渐减少，可证明所纯化的AgrC蛋白具有活性。

为验证所设计构建的AgrA/C双组分信号转导模型，利用EMSA方法进行了评估。结果如图 6所示。泳道1-4采用本研究构建的AgrA/C双组分信号转导模型，即体系中添加AgrC跨膜镶嵌的脂质体，而泳道5-8中以表面活性剂溶解的AgrC蛋白代替AgrC跨膜镶嵌的脂质体。由图 6可知，在两个体系中，当未添加AgrA蛋白时，在标准分子量100 bp之处出现明显的DNA条带(泳道4和8)。比较泳道1-4与泳道5-8，可观察到实验组1 (泳道1-4)中AgrA蛋白与DNA结合能力较强，在小于0.5 μg/μL浓度下即可形成AgrA-DNA复合物并引发条带的迁移，而在实验组2 (泳道5-8)中，只有当AgrA浓度较高时才能观察到明显的条带迁移。在实验组1中，AgrC蛋白镶嵌在脂质体囊泡的二分子膜中，处于接近于细胞膜的自然状态，不仅具有激酶活性，而且可对AgrA蛋白磷酸化，将磷酸基团转移至AgrA蛋白，磷酸化后的AgrA蛋白与DNA的结合能力得到增强，因此在较低浓度下即可观察到明显的条带迁移。在实验组2中，AgrC蛋白溶解于含有表面活性剂的溶液中，尽管其具有激酶活性，但不能对AgrA蛋白磷酸化。

图 7测定了溶解于表面活性剂的AgrC蛋白对AgrA磷酸化及DNA结合能力的影响。1号和6号为对照组，只添加DNA或AgrA，1-5号添加了不同浓度AgrC。从图 7中可以看出，随着AgrC浓度的提高，并没有看到明显的AgrA-DNA条带迁移现象，说明AgrC对AgrA的凝胶迁移率转移影响不显著。

金黄色葡萄球菌作为人类常见的致病菌能引起多种感染，由于其大部分菌株对常用抗生素产生耐药性，控制和治疗由其引发的感染已成为全世界医疗领域急需解决的问题。金黄色葡萄球菌agr信号转导系统作为毒力因子的调控系统，在其致病过程中起决定性作用，已成为新的药物靶点。Williams等在金黄色葡萄球菌耐药性研究过程中，首次提出agr系统可作为新的药物治疗靶点，并对其基因组成及表达调控机制进行了详细的研究[15-16]。美国纽约药科大学的Novick研究团队对金黄色葡萄球菌agr系统中信号分子AIP与受体蛋白AgrC分子识别机理方面进行了较为深入的研究，初步提出AIP的疏水基团能够结合到AgrC的疏水腔使其发生构象变化，进而将信号从胞外转入细胞内[17-19]。美国威斯康星大学的Blakwell团队合成了多种信号分子AIP的类似物，期望得到可抑制受体蛋白AgrC信号接收和传递的抑制剂，其中AIP-III Amid等表现出了良好的活性[8, 10]。

本文利用AgrC蛋白脂质体在生物体外模拟双组分信号转导系统，信号分子AIP被包埋在蛋白脂质体囊泡内，使AgrC处于活化状态，并通过向系统中加入ATP和AgrA开启信号传递(磷酸基团的转移)，使AgrA磷酸化并与含有启动子的DNA结合，最终通过AgrA蛋白的凝胶迁移率转移实验验证该模型的有效性。在构建模型的过程中，我们需要保证每一个组成元件都具有其基础活性，才能保证信号的传递。AgrA蛋白的活性检测是通过非放射性的EMSA来验证。放射性EMSA通常借助P32标记的ATP，结合DNA足迹分析技术检测AgrA在下游启动子之间序列上的结合位点，并借助P32标记ATP的磷酸化分析实验检测AgrA的活性[5]。放射性标记不但对实验条件有严格要求，而且对人体有巨大危害性。本文利用非放射性EMSA法来验证AgrA蛋白的活性，只有当AgrA蛋白正确折叠时，其LytTR区域才能与DNA结合，在聚丙烯酰胺凝胶中才能发生延滞现象，由于AgrA蛋白以二聚体形式与DNA结合，因此可以观察到AgrA蛋白的上移和DNA条带浓度的减弱。

另一方面，当用溶解在表面活性剂缓冲液中的AgrC替换AgrC蛋白脂质体进行EMSA分析时，发现AgrC并不能与AgrA蛋白形成复合物，不能有效磷酸化AgrA并使之与DNA结合。镶嵌于脂质体的AgrC由于具有近似天然膜的疏水环境，更利于其活性的维持，这也与文献中报道的脂质体能提高膜蛋白活性的结论一致[20-21]。

在本研究中，我们初步构建了具有信号传递功能的人工细胞模型，其主要特点是受体蛋白的胞内域朝向细胞外，方便于在体外筛选激酶抑制剂和AgrA-AgrC抑制剂等新型抗菌药物，并且为agr信号通路中磷酸化/去磷酸化机制研究提供新的途径。