PCR实验最常见的9个问题及解决方案

1. 如何有效设计引物

（1）使用Oligo或Primer设计引物，在保守区内设计，长度一般在18-27bp，上下游引物Tm值最好是60-75℃，GC含量=40%-60%，引物自身及引物之间不应存在互补序列，避免发夹结构。

2. PCR电泳无扩增条带

（1）酶失活或在反应体系中未加入酶。TaqDNA聚合酶因保存或运输不当而失活，往往通过更换新酶或用另一来源的酶以获得满意的结果。

（2）模板含有杂质。特别是对甲醛固定及石蜡包埋的组织常含甲酸，造成DNA脱嘌呤而影响PCR的结果。

（3）变性温度是否准确：PCR仪指示温度与实际温度是否相符，过高酶在前几个循环就迅速失活；过低则模板变性不彻底。

（4）反应系统中污染了蛋白酶及核酸酶，应在未加Taq酶以前，将反应体系95℃加热5-10分钟。

（5）引物变质失效。人工合成的引物是否正确。是否纯化，或因储存条件不当而失活。

（6）引物错误。利用BLAST检查引物特异性或重新设计引物。

（7）DNA凝胶电泳时加入阳性对照，确保不是DNA凝胶和PCR程序的问题。

3. PCR产物量过少

（1）退火温度不合适。以2度为梯度设计梯度PCR反应优化退火温度。

（2）DNA模板量太少。增加DNA模板量。

（3）PCR循环数不足。增加反应循环数。

（4）引物量不足。增加体系中引物含量。

（5）延伸时间太短。以1kb/分钟的原则设置延伸时间。

（6）变性时间过长。变性时间过长会导致DNA聚合酶失活。

（7）DNA模板中存在抑制剂。确保DNA模板干净

4. 扩增产物在凝胶中涂布或成片状条带弥散

（1）酶量过高。减少酶量；酶的质量差，调换另一来源的酶。

（2）dNTP浓度过高。减少dNTP的浓度。

（3）MgCl2浓度过高。可适当降低其用量。

（4）模板量过多。质粒DNA的用量应