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GFP(绿色荧光蛋白)是从水母体内发现的发光蛋白,分子质量为26kDa,由238个氨基酸构成。实验室中常用的重组GFP标签更接近水母的GFP,其分子量为27kD左右。 GFP本身是一种酸性、球状、可溶性天然荧光蛋白。按一定规则,11条β-折叠在外周围成圆柱状的栅栏;α-螺旋把发色团固定在几乎正中心处。 GFP的发光机理 物质基础:GFP的生色团 由65~67位的丝氨酸-酪氨酸-甘氨酸(Ser-Tyr–Gly)环化为稳定的对羟基苯咪唑啉酮,形成生色团。 GFP发出荧光稳定,无需再添加任何底物和辅助因子,在紫外或蓝光激发下就能发荧光。在450~490nm蓝光激发下,GFP荧光至少能保持10min以上。适合于活体检测,在激发光照射下的抗光漂白能力比荧光素强。 GFP生色团的形成没有物种特异性,可以在翻译后2~4h通过自动催化作用来合成。 发色团上的共轭 π键能吸收激发光能量,在很短的时间后,以波长更长的发射光释放能量,形成荧光。 例:GFP在水母中能发光,是因为水母素和GFP之间发生了能量转移。水母素在钙刺激下发光,其能量可转移到GFP,刺激GFP发光。这是物理化学中已知的荧光共振能量转移(FRET)在生物中的发现。 GFP的荧光特性 GFP的最大吸收峰为395nm(紫外),并有一个峰值为470nm的副峰(蓝光);发射光谱最大峰值为509nm(绿光),并带有峰值为540nm的侧峰。 GFP的光谱特性与荧光素异硫氰酸盐(FITC)相似,所以GFP观察可用荧光显微镜滤光片组合。 GFP需在氧化状态下产生荧光,强还原剂能使GFP转变为非荧光形式。 GFP的优缺点及改进方法 GFP的优点 易于检测,灵敏度高; 荧光稳定; 对细胞无毒害作用; 广谱通用性; 易于构建载体; 可进行活细胞实时定位观察; 易于得到突变体; 不受假阳性干扰。 GFP的缺点 尽管GFP作为分子探针具有多种优点,但野生型GFP仍具有一定缺点: GFP有两个激发峰影响特异性,且长波激发峰强度较小,不易观察; GFP合成及折叠产生荧光的过程慢,蛋白质折叠受温度影响大,表达量较低; GFP在某些植物细胞中不表达。 改进方法 ①除去GFP基因中隐蔽型内含子; ②消除编码蛋白的积累; ③将GFP定位到特定细胞器中; ④改变碱基组分; ⑤更换GFP生色团氨基酸; ⑥插入植物内含子; ⑦增加增强子和更换强启动子。 GFP融合蛋白的构建 应用亚克隆技术将目的基因与GFP基因构建成融合基因,通过愈伤组织转化法、基因枪、显微注射、电激转化等方法转化到合适的细胞,利用目的基因的表达调控机制,如启动子和信号序列来控制融合基因的表达,最终得到融合蛋白(尽可能不影响目的蛋白的定位和功能)。 目的蛋白与GFP基因融合方式: 目的基因-GFP(将GFP置于目的基因之后) GFP-目的基因(将GFP置于目的基因之前) 注意事项: 两个基因之间用Linker连接; 在两个基因交接处增加一段核苷酸(3的倍数)使得两个基因的蛋白产物的空间结构相互影响较小,有利于GFP发光; 基因在GFP之前时必须要有起始密码,不能有终止密码;基因在GFP之后必须有终止密码; 构建融合基因后,必须测序进行验证,确保融合基因读框正确之后才能进行后续研究。 GFP融合蛋白的检测 定性检测:可以用常规的落射荧光显微镜或者共聚焦显微镜观察; 定量检测:免疫印迹法,酶联免疫吸附法; 可以在活细胞中进行图像分析,也可以检测固定细胞中的GFP。 注意事项: 以GFP作为报告基因研究蛋白亚细胞定位,必须作对照。必须识别自发荧光与GFP的绿色荧光,以免假象干扰; 构建正确的融合基因不一定都能正常表达,要尽可能多的获得转基因细胞。 |
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