高分辨质谱必备知识点二（ESI源中常见的背景离子/干扰物）

摘要

随着电喷雾电离和基质辅助激光解吸/电离的发明，采用现代质谱法的科学家会面临背景干扰和污染物方面的新挑战，这些在传统或其他分析技术中可能有很大影响。为了不断减少样品体积和可测量浓度的，我们需要了解这些干扰的来源、如何识别它们以及是否可以消除它们的干扰以进行准确的目标物质量的测量。这篇综述总结了当前有关报告污染物的文献，并介绍了过去十年在实验室中许多新观察到和确定的干扰。这些包括蛋白质和非蛋白质性质的化合物。在补充文件中，提供了一个电子表格，其中包含迄今为止鉴定出的所有化合物的可搜索离子列表。

1 . 介绍

“Scheidekunst”——（将材料分离成单独成分的“艺术”）一个古老的德语词，用于表示炼金术和分析化学相关科学，它的基本概念今天仍然有效。在过去的一百年里，结合大量分析物检测技术，色谱和其他分离方法取得了巨大进步。任何分离和检测技术都有可能无意中将新成分或污染物引入分析系统，必须对其进行评估和仔细考虑。因此，现代分析化学尽可能利用超纯化学品和试剂以及超净样品处理容器来最大程度地减少任何潜在的和不需要的背景干扰。此外，所有遵循良好实验室规范 (GLP) 的常规现代分析方法都将包括空白测试，例如系统、溶剂、方法、基质和仪器空白。

随着用于现代质谱 (MS) 分析的新型电离方法的引入，例如电喷雾电离 (ESI)、基质辅助激光解吸/电离 (MALDI)。在 80 年代后期，使用现代质谱工具的科学家面临着关于背景离子的新挑战，这些挑战在传统或其他完善的常规分析方法中可能没有影响。正在进行的进一步小型化液相色谱 (LC) 方法、LC/MS 组合、毛细管电泳结合 MS (CE/MS)包括基于微流控芯片的质谱的发展，具有预测潜在干扰和背景离子的知识对于未来在常规和研究分析方法中成功开发 GLP 方法将变得越来越重要。样品转移程序和处理工具的小型化使比表面积比呈指数增长，因此任何由污染或背景浸出表面引起的干扰也会随之增加。

这篇综述的主要重点是介绍和描述已知和确定的干扰化合物，这些化合物要么在科学文献中报道，要么在过去十年左右的时间里在自己的实验室中观察到，以及在适当和可能的情况下如何将所述干扰的影响降至最低的一般技术建议。

本报告不包括或进一步讨论允许最小化或消除某些背景干扰的特定技术或仪器，例如离子迁移率 MS、高场不对称波形离子迁移率光谱法 (FAIMS) 、无基质激光解吸/电离技术包括硅上解吸/电离 (DIOS)、解吸电喷雾电离 (DESI) 、或直接实时分析 (DART) 。随机背景噪声的来源和处理，无论是电或化学性质、通过特殊软件应用程序降低噪音、分析过程中通过分析物/药物的降解或代谢引入的干扰、共翻译或翻译后蛋白质修饰、通过与二甲硫醚的特定反应进行背景离子洗涤或任何特定于分析物的干扰也超出了这项工作的范围。我们希望对上述主题感兴趣的读者参考各自引用的文献和其中的参考资料。

补充数据包含一个电子表格 (Microsoft-Excel)，其中包含迄今为止所有已识别化合物的可搜索汇编。该列表包含单电荷物质的准确质荷比，这些可用于需要准确质量测量的应用中的校准目的。（关于EXCEL表格大家可以登录源网站下载）

2 . 蛋白质干扰或污染物

现代质谱的重大影响之一是对蛋白质分析和表征。MS 相关技术现在是蛋白质鉴定和定量的首选的方法。生物样品的复杂性需要广泛的纯化和分离方法，不仅要去除非蛋白质成分，还要解决现有的不感兴趣的蛋白质。在这里，我们将关注潜在的干扰蛋白质，这些蛋白质不是原始样品固有的，或者是不由自主地引入样品（例如角蛋白），或者是故意作为酶试剂添加的，例如在用于后续质谱分析的自下而上样品制备中（关于蛋白分析——自上而下还是自下而上，我后面会单独出一篇，感兴趣的小伙伴可以关注我哦）。

2.1 . 用于生物分析质谱样品制备的酶

用于后续质谱分析的蛋白质样品制备的典型自下而上方法包括对感兴趣的蛋白质进行酶消化，然后进行肽图分析和/或气相分离肽离子的 MS/MS 碎裂。 在理想情况下，样品蛋白质大量过量，因此添加酶的潜在干扰最小。然而，现代质谱的巨大成功之一是使用色谱或凝胶电泳技术分析从复杂混合物中分离和纯化的通常低纳克量的蛋白质。在这些情况下，酶与蛋白质的比例通常会发生逆转，因此酶自溶产物的潜在干扰变得显着，需要加以解决。牛和猪胰蛋白酶是 MS 蛋白质分析方案中最常用的酶，但“困难”蛋白质，例如具有很少或不可接近的胰蛋白酶裂解位点的膜蛋白，可能需要其他酶来进行充分消化。虽然，胰蛋白酶的自溶产物已在文献中有所描述，由于不同实验条件下消化结果的差异，酶自溶的空白试验仍然是可取的。为了最大限度地减少来自酶或其他来源的肽人工制品的干扰，有必要优化消化条件并使用高纯度的蛋白水解酶。后者可能具有挑战性；酶的纯化需要不影响其活性的技术。图1总结了最常用的酶，包括它们的特定切割位点和它们的在线数据库登录号（SwissProt 数据库）。在需要连续多酶消化的情况下，例如在需要最大蛋白质序列覆盖率的实验中，潜在干扰的复杂性自然会增加，并且需要进行复杂且充分的空白测试实验。

最近出现了新的有前途的方法和技术，可以避免在样品制备中使用酶来对蛋白质进行质谱表征。这些包括用于受控蛋白质消化的微波辅助酸水解，或全蛋白质的自上而下 MS 分析。然而，由于稳健的酶消化方法被广泛接受，以及新方法的初始挑战，在不久的将来，酶在质谱样品制备方案中的使用不太可能被显着取代。

2.2 . 角蛋白和其他丰富的、不由自主地引入的蛋白质

角蛋白是普遍存在的蛋白质，主要来源于皮肤细胞，通常存在于家庭和实验室灰尘中，如果不采取适当的护理和预防措施，有可能污染生物样品。 由于它们的蛋白质性质，污染的角蛋白也不可避免地在用于质谱分析的各个自下而上的样品制备中经历酶消化，并且产生的肽将干扰感兴趣的蛋白质的分析。目标蛋白质的丰度越低，角蛋白干扰分析的可能性就越大。因此，避免角蛋白干扰的必要措施将取决于所研究的样品，范围可以从简单地戴上手套到在层流罩中工作或在特殊洁净室中工作。Biringer制定了关于如何以及何时避免角蛋白干扰的极好指南。1999 年，Mann 及其同事提供了一份综合清单，其中包含常见肽污染物的各自 MS/MS 数据包括角蛋白，这些污染物包含在我们的补充电子表格中。人们可以预期，在灰尘中发现的大多数角蛋白来自人类，这对于大多数实验室来说很可能是真实的，但是，如果实验室动物设施包括在内或附近或发生啮齿动物侵扰，则来自相关物种的相应角蛋白也应该是预期的。谨慎的实验室实践中的另一个特权是做好准备和保持警惕；在一项研究小鼠内质网蛋白质组的重大项目中，我们开始一次性鉴定出大量高丰度的绵羊角蛋白。事实证明，由于室外温度突然下降，一名实验室成员在合作者的样品制备实验室开始穿着羊毛衫。

许多其他蛋白质可以不由自主地引入生物样品中。其中包括牛血清白蛋白 (BSA)，它通常用于免疫测定和其他技术，作为一种试剂来阻断表面上的非特异性结合位点，或者蛋白 A 和 G，它们用作免疫球蛋白 (IgG) 的特异性结合伙伴。 在亲和纯化方法中，通常，亲和柱的所有蛋白质成分，包括固定抗体，都有可能泄漏到样品组分中。基于溶液的免疫沉淀中使用的抗体通常过量，以至于不可能对感兴趣的蛋白质进行质谱表征，除非有效地从感兴趣的蛋白质中去除（例如通过 HPLC 或凝胶电泳）干扰抗体链。当使用脱脂奶粉、鱼明胶或全血清作为试剂来封闭生物分析方法中使用的设备表面的非特异性结合位点时，可以将更复杂的蛋白质混合物引入样品中。

图2总结了最常见的污染角蛋白和其他蛋白质及其各自的在线数据库登录号（SwissProt 数据库）。来自这些蛋白质的干扰肽的出现在很大程度上取决于具体应用的实验条件，并且变化很大。在我们的补充数据库中，我们只包含了一些在我们自己的实验室中观察到或在文献中报道过的最突出的例子。然而，根据所采用的实验条件创建这些蛋白质的“计算机”肽图是一项简单的任务。然后可以将这些理论肽图与实验结果进行比较，并确定源自这些蛋白质的潜在肽伪影。

2.3 . 仪器诱导的肽片段干扰

分析物电离过程中的非特异性源内肽碎裂会导致来自酶促生成肽的意外信号。这种现象已被用于ESI 和 MALDI中的伪 MS 3实验。电离源中非特异性碎片的强度与 ESI 中施加的撇渣器喷嘴电压以及所采用的基质和 MALDI 中施加的激光强度有关。可以采用上述因素的修改和优化来最小化这些干扰。在最近关于低能量碰撞诱导肽断裂化学的研究中，证明当肽上的质子定位时，C 端切割为酸性残基（D，E）占主导地位，而当质子移动或部分移动时，N 端切割为脯氨酸占主导地位。这与我们的观察结果一致，即上述源内片段化通常会产生特定的肽片段（D、E 或 N 端切割后的 C 端切割在 P 之前），我们已经包括了由角蛋白或我们补充数据库中的酶来源并标记为离子源片段。

一长串潜在的非蛋白质干扰物既包含传统分析方法中公认的污染物和化合物，例如增塑剂和抗氧化添加剂，也包括现代质谱所特有的多种干扰物光谱分析，如 MALDI MS 中的基质簇，以及 ESI 中的金属离子或溶剂加合物和其他溶剂效应。一些仪器和样品制备工具制造商已经发布了他们自己的特定干扰清单，随着新材料的不断开发、新基质物质的引入以及对大气压力电离源周围环境干扰的认识不断提高，潜在背景离子列表有望保持稳定增长。

3.1 . MALDI MS 中的矩阵簇

Dubois 等人首先详细描述了矩阵簇的观察。从那时起，许多报告都涉及这个主题；主要为常见基质化合物α-氰基-4-羟基肉桂酸（4-HCCA）和2,5-二羟基苯甲酸（DHB）。Keller 和 Li 建立了以下关于 4-HCCA 和 DHB 作为基质分子和碱离子（通常是钠和钾）团聚体的基质簇组成的算法，该算法允许预测可能出现矩阵簇的m / z值。例如，在常用的基质物质 4-HCCA 的情况下，基质簇通常出现在束中，其中包含约 3-7 个特定信号。束被 ∼190–227 个质量单位隔开，代表一个基质分子单位（即 [M  +  H]、[M  +  Na] 或 [M  + K]）。在一束内可能有几个强烈的单个信号被较弱的簇信号包围，并且平均束强度随着束平均质量的增加而降低。使用现代的高分辨率质量分析器，可以很容易地从潜在的肽信号中辨别出基质簇，如图 3 所示。Liang Li 博士的小组网站上提供了一个在线程序，该程序允许基于上述算法预测和确认 4-HCCA 或 DHB 的潜在基质簇质量，包括潜在的中性失水（参见：www.chem .ualberta.ca/∼liweb/links/MaClust.htm）。哈里斯等人。报道了使用 4-HCCA 和胰蛋白酶自溶信号的基质簇的准确质量来校准肽图实验。有趣的是，当 4-HCCA 基质簇仅包含钾作为碱离子且钾离子的数量与基质分子的数量相匹配时，他们发现上述算法失败。在这种情况下，观察到的团簇质量比预测的质量少一个质量单位，作者用由于潜在的光电离机制导致的氢原子损失来解释这一点。

减少基质簇的出现和干扰的明显手段是避免或最小化基质和样品的盐污染，这可以通过对样品/基质斑点进行目标清洗来实现、样品/基质沉积前的样品纯化或两种方法的组合。纽伯特等人。Smirnov 等人采用后源衰减 MS/MS 分析将基质簇与肽信号区分开来。利用柠檬酸二铵缓冲液的洗涤步骤来消除或减少 4-HCCA 基质簇，和金等人。在样品/基质制备中加入次氮基三乙酸，实现基质簇抑制和肽信号增强。

由于基质簇的形成是非常动态的，并且取决于许多因素，包括盐污染、应用的激光功率、基质物质的选择、样品类型和分析物丰度，我们在我们的研究中只包含了 4-HCCA 基质簇信号的最突出的例子。补充数据库，通常在我们实验室的典型肽图实验中观察到。

3.2 . 加合物、溶剂和聚合物干扰物

在 ESI 和 MALDI 分析中经常观察到与溶剂分子、碱或其他金属离子或其他污染成分形成加合物。事实上，现代质谱中观察到的大多数离子是加合物离子或假分子离子（例如 [M  +  H] +、[M  +  NH 4 ] +、[M  +  Na] +或 [M  +  K] +）。优选的离子类型是质子化分子离子，尤其是在肽分析中，因为与钠化肽离子相比，部分移动的质子电荷能够进行更有意义的碎裂分析。此外，质子化分析物信号的出现表明所使用的仪器是干净的，不会对分析过程产生任何污染的阳离子成分。然而，也有许多例子，其中加合物的形成，例如碱金属或其他金属离子，是不可避免的或确实是可取的，因为它们提高了特定化合物的电离效率或帮助稳定分析物的气相形式。在这种情况下，甚至可能需要有意地将盐成分添加到 ESI 中的溶剂系统或 MALDI 中的样品/基质混合物中。在银的情况下，这也会导致簇干扰，或者在负模式下有意添加卤化物阴离子，在正模式下故意添加铵、烷基铵缓冲液和铵盐，用于特定分析物的定量 LC/MS 研究组。

预测哪种溶剂系统、基质化合物和潜在添加剂最适合特定分析物并不总是可能的，而且通常情况下，每个新分析物类别都需要单独的方法开发。学术服务和研究实验室经常遇到的一个特殊问题是分析与典型电喷雾溶剂（例如甲醇、乙腈、水或其他醇）不兼容的金属有机化合物或其他化合物。对于这些情况，我们发现干燥的硝基甲烷通常是一种很好的替代品，可以实现或增强质谱分析，例如在金属有机化合物的情况下，不会形成溶剂加合物或诱导分析物降解。图2显示了一个二硼化合物的例子[78] 除了干燥的硝基甲烷外，在任何其他溶剂系统中都无法检测到。

图2。在 QSTAR XL QTOF MS（Applied Biosystems，位于皇后大学的仪器）上获得的二硼化合物（Cui 和 Wang，2006）的电喷雾 MS 光谱摘录，在正模式下使用常规电喷雾源，流速为 6  μl /分钟。(A) 使用不同溶剂（例如甲醇、乙腈、水和添加的 K +离子（如 KNO 3）。(B) 当使用干燥的硝基甲烷（Sigma-Aldrich，Oakville，ON）时，该化合物获得了强烈的钾化信号。钾不是故意添加的，而是溶剂中固有的，很可能来自分子筛。获得的单电荷同位素模式与理论模型非常吻合（见插页）。可以观察到来自双电荷二聚体 ([M 2  +  2K] 2+ )的微弱干扰（*标记信号）。

Tong 等人发表了对电喷雾质谱中典型加合物形成的综合说明。1999 年，包括对如何在高通量应用中质谱解释的自动“数据处理”中使用这些信息的描述[79]。我们在我们的补充电子表格中包含了 Tong 等人关于加合物形成的结果，并补充了几个仪器或配件供应商的可用信息和我们自己的实验室结果。

在自制的 ESI 离子阱-TOF 质谱仪的扩散泵中使用的硅油的两种成分，即四苯基-四甲基-三硅氧烷和五苯基-三甲基-三硅氧烷，被发现在蛋白质分析中形成加合物，并已被 Purves 描述等。1997 年改用更高等级的扩散泵油解决了这个问题。

在使用芥子酸作为基质化合物的蛋白质的 MALDI 分析中，蛋白质信号通常伴随着相隔约 206 个质量单位的第二个信号，它已被认为是芥子酸的光化学加合物。

数十年来，聚合物干扰一直是成熟和传统分析技术中的一个问题。其中包括普遍使用的聚乙二醇 (PEG) 和聚丙二醇 (PPG)。由于能够分析生物样品，现代质谱会遇到额外的聚合物干扰，这些干扰通常有意添加到生物样品制备中。这其中有非离子型去污剂聚氧乙烯脱水山梨醇单月桂酸（吐温®），用于除去外周膜蛋白和苄基-聚乙二醇叔辛基苯基醚（曲通的®），用于辅助蛋白质的凝胶电泳分离。

聚合物干扰源可能来自实验室中所有类型的塑料器具，包括样品瓶、小瓶、移液器吸头、移液管灯泡和过滤膜。根据样品的性质和样品制备程序，必须仔细选择塑料器皿与玻璃器皿或所用塑料器皿的类型（例如特氟龙与尼龙等……）。一个好的起点是就兼容性问题咨询各自塑料产品的制造商，但在大多数情况下，这种方法不会完全消除对实验室内部测试和良好实验室实践协议开发的需要，以最大限度地减少塑料器具中聚合物干扰的浸出。在这方面需要指出的是，应避免使用腐蚀性溶剂、酸或碱来清洁塑料制品。

在环境空气的干扰polydimethylcyclosiloxanes通过施罗瑟和Volkmer-Engert于2003年报道和环状聚酰胺低聚物从尼龙66个滤器浸出到2004年被Önnerfjord被描述的LC溶剂流在2006年和由Tran和Doucette鉴定。

应该注意的是，加合物形成和聚合物干扰通常可以通过它们不同的重复单元来识别。表 3总结了最常见的重复单元及其来源。此列表也包含在补充数据电子表格中。重复单元通常不具有电荷特异性，但是一些重复单元，例如三氟乙酸簇（TFA，酸形式）、高氯酸钠 (NaClO 4 ) 和十二烷基硫酸钠 (SDS) 仅在负模式下报道过。

3.3 . 增塑剂、添加剂和其他干扰物

众所周知，邻苯二甲酸酯等增塑剂和抗氧化剂等添加剂会干扰分析技术，已被很好地表征并列在许多仪器或附件供应商的技术说明中。Verge 和 Agnes 于 2002 年报道了他们的电喷雾质谱设置中使用的真空 O 形圈中邻苯二甲酸酯的释气和干扰。Gibson 和 Brown 在 2003 年报道了使用 LC/MS 与在线放射性物质检测 (LC/RAM/MS/MS) 联用的闪烁混合物中的成分二甘醇单丁醚 (DGBE) 的干扰。 Xia 等人报道了在聚丙烯小瓶中发现的抗氧化剂 3,3'-硫代二丙酸双十二烷基酯 (DDTDP) 的亚砜氧化产物的浸出。2005 年。在对电喷雾背景干扰的综合研究中，Guo 等人。将常见的增塑剂和其他污染物归类到家谱中。

高压灭菌是对科学分析设备或生物样品的储存容器进行消毒的常见做法，不幸的是，生物样品有可能将污染物引入分析流中。例如，从涂漆容器中浸出双酚 A 等异种雌激素，从储存袋或医用管中浸出邻苯二甲酸酯等增塑剂，以及在大鼠食物中形成丙烯酰胺，据报道，在高压灭菌过程中。

最近，我们能够鉴定出三种季铵化合物，它们在 MALDI 和 ESI 中经常被观察为强背景离子，并且之前已经发现作为未知污染物进入了许多背景离子列表。这些化合物的特性通过母离子和 MS/MS 碎片的精确质量测量得到确认。表 4列出了三种化合物的结果，图 3显示了二硬脂基二甲基季铵离子的 MS/MS 谱图；所有测量的质量都在 1 以内 计算的理论分子量的 ppm 质量误差。这些化合物的可能来源是个人护理产品，其中这些化合物通常作为柔软剂添加。

前两个工作表选项卡以正 (+ve) 或负 (-ve) 模式显示单电荷背景离子列表。正离子列表包含 650 多种在文献中报道或在我们实验室中观察到的物种。负离子列表仅包含文献中报道的物种，但应注意，正离子列表中列出的大多数背景物种（季铵物种除外）在去质子化或阴离子加合物形成后可能会干扰负离子模式.

新型质量分析器（例如具有精确质量测量能力的正交 TOF 或 FT-ICR-MS）的广泛引入促使我们决定计算背景离子的精确单同位素质量；将此列表与大多数其他可用干扰列表区分开来的功能。我们还在计算中加入了电子的质量。

对于这两个离子列表，我们决定不包括任何多电荷离子，因为多电荷离子的形成取决于个人设置、使用的溶剂、酸和其他条件，如果多电荷是由于各种阳离子和可能是质子。此外，在许多情况下，多电荷离子的出现通常伴随着单电荷物质，并且大多数软件程序将具有将多电荷离子转化为单电荷物质的软件选项。

第三个选项卡包含聚合物或加合物干扰的常见重复单元列表，表 3 中也显示了该列表. 第四个选项卡包含文献中报告的常见加合物形成、置换反应和观察到的损失的列表。第五个选项卡包含一个电子表格，其中包含我们计算中使用的原子质量列表。电子表格设置用于确定任何化合物的准确理论质量，然后可以轻松地将其与观察到的质量进行比较。第六个选项卡包含常用溶剂列表，包括常用于 NMR 研究的氘代溶剂。第七个选项卡包含报告这些背景干扰的参考文献列表。每个参考的字母标签包含在单独列中的背景离子、重复单位或加合物列表中。第八个也是最后一个选项卡包含一个词汇表，其中简要说明了数据库中使用的一些缩写。

我们已经编制了一个综合数据库，其中包含文献中报道和在我们自己的实验室中观察到的现代质谱分析中目前已知的潜在干扰和背景离子。很明显，这样的列表永远不会完整，因为现代质谱仍然是一门快速发展的年轻学科，新的化学品和材料不断被引入样品制备组件和质谱仪本身。

因没有找到上传办法，需要EXCEL表格的可以私聊我转发给你，或者有Elsevier账号的小伙伴可以查找文献自行下载，对排除解释部分干扰峰有很大帮助。