分子生物学实验技术

琼脂糖是由半乳糖及其衍生物构成的中性物质，不带电荷，在高温溶液状态下是无规卷曲状态，当冷却时，通过氢键形成螺旋纤维，继续保持较低的温度，螺旋纤维之间在“节点”靠氢键连接形成三维结构即为凝胶［6］。胶结构均匀，含水量大（占98%～99%），对样品吸附极微，电泳图谱清晰，分辨率高，重复性好，需样量少，是核酸平板凝胶电泳的常用方法，也可用于大分子蛋白的分离和鉴定［7］。凝胶中琼脂糖的浓度愈大，形成的空隙愈小。不同浓度的琼脂糖凝胶分离DNA分子大小如表1-2所示。

表1-2　琼脂糖浓度和DNA分子大小的关系［7］

凝胶电泳不仅可以进行核酸片段分析，还可以作为分离纯化DNA分子的手段。琼脂糖DNA片段回收方法有透析法、反复冻融法、低熔点法及试剂盒回收法等［8，9］，磁珠法也是近几年兴起的回收琼脂糖凝胶电泳DNA片段的方法。

学习将获得的核酸片段进行琼脂糖电泳分离、鉴定及用酚/氯仿从凝胶中回收质粒DNA的基本方法。

DNA等电点较低，在特定的缓冲条件下带负电荷的DNA分子向正极方向移动。其移动速率依赖于分子片段的大小，分子愈大，移动速率愈慢。特定大小的DNA片段在不同浓度的胶中移动速率均不同，可用DNA marker（DNA标记）来比较它们的大小。核酸经荧光染料染色嵌入核酸碱基中，以紫外线激发产生荧光，通过核酸的位置判断核酸分子的大小及分离效果。

商品化试剂盒及磁珠法提取获得的E.coli质粒pET-28a。

50×TAE电泳缓冲液、1.5%琼脂糖、上样缓冲液（含溴酚蓝指示剂）、核酸染料GoldView（10000×）、10kb的DNA marker、酚/氯仿（1∶1）、10%CH3COONa、无水乙醇、70%乙醇。

电泳仪、电泳槽、凝胶自动成像仪、微波炉、离心管、冰箱、台式离心机、电子天平、微量移液器（20μL、1000μL）。

（1）将1.5%琼脂糖凝胶置于微波炉中加热至琼脂糖完全熔化（注意！防止突沸及胶液外溢）。让琼脂糖在室温下冷却30min以上，待手持胶液不烫手时，加入3.0μL荧光染料（GoldView）混匀，随即倒入电泳槽内，插上梳子后使之凝结。未使用的电泳胶片可以用保鲜膜封存，或浸入1×TAE缓冲液内，置于4℃冰箱中，留待下次再使用。

（2）取5μL的E.coli pET-28a质粒DNA溶液与2μL上样缓冲液混合，加入到齿孔，并在其他齿孔中加入5μL的DNA marker进行比较，连接电源插头（黑色为负极-，红色为正极+），带负电荷的DNA分子会由负极移向正极，80～100V电泳1h，或直至上样缓冲液染剂前端距胶底1.5cm（注意！勿碰触高压电的电泳仪器）。

（3）将胶取出，置于凝胶自动成像仪，紫外灯下观察、拍照。

（4）切胶称重，-20℃冻融捣碎2次。

（5）等体积酚/氯仿，振荡5min（如果胶的量少，可将酚/氯仿的比例提高），12000r/min，5min。

（6）取上清液，加入10% CH3COONa混匀，再加入2倍体积无水乙醇混匀，12000r/min，10min。

（7）弃上清液，离心管中加入70%乙醇500μL，12000r/min，5min。

（8）弃上清液，干燥即得。

通过电泳图谱可以检测所提DNA片段的大小和相对纯度，也可以进行特定片段纯化。在细菌细胞内共价闭环DNA质粒以超螺旋形式存在，若在提取过程中质粒DNA其中一条链有断裂或多处断裂但不在同一位置，则解螺旋成环状DNA分子，若在2条链的同一处断裂，则成线状DNA分子。若出现后两种情况，电泳迁移速率为：共价闭环DNA>直线DNA>开环的双链环状DNA。图1-2为商品化试剂盒与磁珠法提取质粒DNA电泳图，可通过条带判断DNA分子的纯度及分子大小。

图1-2　纯化的质粒DNA pET28a电泳图［5］

M—DNA marker；1—商品试剂盒（硅胶柱）提取质粒；2，3—Fe3O4@SiO2提取质粒

（1）戴手套把琼脂糖放在强UV（紫外线）透射光源板上，300nm紫外线激发即可对结果拍照存档，尽量减少身体（脸或手）和胶体暴露于UV下过久，有时会使DNA产生缺口或突变。

（2）以刀片将E.coli pET-28a质粒载体DNA切下，做DNA纯化及浓缩，若分离的DNA条带过细，可适当增加酚/氯仿的比例。

（1）琼脂糖凝胶电泳分离DNA分子量的范围是多少？

（2）为何琼脂糖凝胶电泳适合作为核酸分离介质？

（刘长霞）