BacDrop单细胞微生物测序方法揭示与抗生素相关的细胞异质性

转自：优宁维抗体专家

过去的几年里，单细胞RNA测序（scRNA-seq）已经在动植物中取得了许多重要的发现，极大的加深了我们对细胞类型和细胞状态的转录异质性的认知。

然而，相较于传统的模式物种，甚至是非模式物种来说，微生物中单细胞转录组测序进展缓慢。最近报道的几种方法microSPLiT、PETRI-seq、MATQ-seq都存在一定的限制：比如捕获细胞数量通量较低，测序reads中冗余的rRNA掩盖了其他的基因表达信息，影响了对于细胞状态的探究。虽然基于探针的方法可以有效的选取研究人员感兴趣的区域与基因，但是对基因的数量也有一定的限制。在研究层面，如果研究人员想将研究精度扩展到种群内，对种群内进行进一步的划分还是需要有新的方法提出来。

今天我们给大家介绍一个关于微生物单细胞的测序技术及应用：《Bacterial droplet-based single-cell RNA-seq reveals antibiotic-associated heterogeneous cellular states》，该文章于2023年1月27日发表于《CELL》。

首先作者提出了一个总结，基于真核生物的scRNA-seq来看，对于大量细胞的浅层测序相对于小规模细胞的深度测序是更有利的实验设计。作者认为，同样的生物学和统计原理扩展到细菌的单细胞转录分析中也同样重要。此外，如果样本具有高度的复杂性与多样性，大规模的细胞数量有助于发现更加精细的亚群种类。

基于此作者开发了BacDrop，一种基于液滴的全基因组并行的大规模细菌scRNA-seq测序技术。BacDrop在实验中对于细胞数量的兼容性很高，从数千到数百万个单个细菌细胞，并且不需要基因组或探针设计的先验知识。BacDrop流程中包括一个通用和高效的rRNA消化步骤，此举可以将测序成本降低了至少10倍，同时也可以获得更多的细胞转录信息。作者证明了BacDrop对多种细菌起作用，包括革兰氏阴性大肠杆菌、肺炎克雷伯菌、铜绿假单胞菌和革兰氏阳性屎肠球菌等。并且作者将此方法应用于肺炎克雷伯菌（作为导致抗生素耐药性的主要原因之一）。在静态与动态扰动（添加抗生素）下评估其群体内的异质性, 发现在两种情况下分别存在不同的机制导致其异质性的产生。

BacDrop方法概括

简单来说，BacDrop通过对比较成熟的商用方案进行改进，基于细菌的特性与细胞壁的考虑，需要更严厉的溶解条件同时保持RNA完整性，并且和缺乏mRNA polyA，因此需要另一种方法来分离mRNA（5%）和丰富的rRNA（95%）。作者采用了先前报道的细胞固定和渗透方案，以避免在液滴封装之前的细胞裂解，并分别在渗透后使用RNase H和DNase I在固定细胞内实施了通用的rRNA和基因组DNA（gDNA）消化步骤。

基于液滴的单细胞方法需要以平均液滴占用值(λ)远小于1来进行泊松加载，以确保多个细胞不封装在单个液滴中，从而保证条形码的唯一性，然而这也就限制了每个微流控通道中可以加载的细胞数量。所以作者提出可以使用一种pre-indexing的方法，该方法可以通过逆转录加上plate barcode（CB1），CB1由384个不同的条形码组成，同时第二种是基于商业化的磁珠上的条形码,即液滴条形码（CB2），结合CB1与CB2，每个液滴中可以装载3-6个细胞也可以保证细胞的唯一性。通过将λ由原来的0.3提升到1，可以极大的扩展细胞的数量范围。另外，由于细菌mRNA的5’端缺乏适当的修饰，在模板切换步骤中，细菌第二链cDNA合成的效率低于哺乳动物，作者使用末端转移酶（TdT）将poly (A)尾巴附加到cDNA的3’端，以促进液滴内第二链cDNA的合成。

图一：BacDrop实验流程及文库图

BacDrop的技术性能评估

基于上述的方法，读者可能会比较关心几个问题

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去除rRNA之后，mRNA的表达是否一致？

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细胞固定是否会对细胞状态造成影响？

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液滴中含有多个细胞是否会造成多细胞率增加？

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细胞表达特异性是否得到保留，对于不同菌的区分度如何？

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基因的检测数量？细胞的捕获效率？

基于此，作者进行了一系列的实验评估与验证。

首先，作者发现，rRNA消化之后，mRNA reads的比对率从5%增加到了50%-90%，同时与未消化完全的rRNA的样本的相关性也较高（R2 = 0.81；图2B）。此外，作者也证实了表达谱不受细胞固定的影响（R2 = 0.97），并且BacDrop产生的转录谱与传统的bulk RNA-seq方法产生的转录谱相关性也较高（R2 = 0.91；图2D）。由于使用每个液滴装载多个细胞，会导致最小的细胞条码碰撞率（cell barcode collision rates）。接下来作者构建评估实验，使每个液滴平均包含六个细胞，对两个可区分的肺炎克雷伯菌和铜绿假单胞菌进行上机测试，质控后获得44,140个细胞，42,893个细胞（97.2%）>99%的UMIs比对到单一物种，而其他1247个细胞（2.8%）至少有1% 的UMIs分别比对到两个物种上。与已发表的真核生物液滴scRNA-seq方法（0.36%至11.3%）相比，该结果得到的条形码碰撞率为6.6%。

接下来作者将BacDrop应用于革兰氏阴性大肠杆菌、肺炎克雷伯菌、铜绿假单胞菌和革兰氏阳性屎肠杆菌来评估是否可以基于表达水平将这四种菌进行区分，结果显然可见，降维之后可以将不同的细菌进行有效的区分，同时作者还发现实验中离心步骤造成了特定细胞的损失，并且优化了离心步骤。接下来，作者进一步在不同大小的文库试验了细胞的捕获率与基因的覆盖率，发现BacDrop的表现均较好。

最后作者也使用了三株gfp不同表达水平的大肠杆菌，验证BacDrop区分基因不同表达水平的敏感性。作者先使用流式确认了gfp在这些菌株中的不同表达水平，并使用RT-qPCR估算了这些菌株中gfp的mRNA拷贝数。实验证明，BacDrop与两者的表达趋势一致，并且BacDrop算得的gfp表达水平在三株之间有统计学差异。

图二：BacDrop的验证与评估

BacDrop用于鉴定细菌细胞亚群的表现

既然BacDrop是一种稳健和可靠的技术，具有足够的覆盖率和灵敏度，可以应用于不同数量的细胞和物种，并且在区分不同的细菌表现的都十分优秀。作者提出是否可以在同种细菌中进一步区分出不同的亚群。作者选择在没有抗生素和存在抗生素扰动的情况下，探索肺炎克雷伯菌MGH66的生物学异质性，作者将MGH66培养物（OD600~ 0.2）分成四个相同的培养物，其中一种不经处理，其他三种用具有不同作用机制的抗生素处理，包括：抑制细胞壁合成（美罗培南）、抑制DNA合成（环丙沙星）和抑制蛋白质合成（庆大霉素）。

作者首先进行了bulk RNA-seq，如预期一致，相对于未处理的对照，细菌对每种抗生素有不同的细胞反应，环丙沙星诱导的参与主要DNA损伤反应（SOS反应）的基因，如recA，而庆大霉素治疗诱导了一组热休克伴侣蛋白，如ibpB等。接下来，作者基于四种CB1来标志不同的处理与对照，进行单细胞测序，不同重复的测序深度在3000~5000 reads/cell。通过比较不同的重复样本，重复间无较强的批次效应。细胞根据不同的治疗条件聚集，其中美罗培南处理和未处理的样本之间的重叠，与它们的bulk RNA-seq结果一致，表明至少在种群水平上，美罗培南对转录的影响相对较小（图3B）。在两个重复中，72%和56%的环丙沙星处理的细胞属于SOS反应簇，而72%和66%的细胞属于热休克反应簇，在两个重复中具有良好的重现性（图3E）。这些实验证实了BacDrop可以重复识别种群的异质性。

图三：BacDrop用于鉴定细菌细胞亚群的表现

BacDrop揭示了：

亚群异质性主要是由MGEs的表达驱动

既然验证了BacDrop可以有效的揭示群内的异质性，于是作者在单细胞水平上深入分析了未经处理的MGH66培养物，以了解它是否包含任何以前未被识别的群体内异质性。首先作者一共检测了50,000个细胞，其中每个细胞至少含有15个基因。接下来使用无监督聚类方法在两个重复中确定了两个主要的亚群，虽然大多数细胞属于一个主要的同质亚群，但有2,191个细胞（4.5%）属于由IS903B转座酶基因驱动的MGE亚群，该基因在MGH66基因组上有83个拷贝。作者发现该亚群事实上在其他处理的样本内也存在，提示这种亚群的存在是一个稳定的现象。接下来作者使用了流式进行了进一步的分选，根据表达水平将细胞分选为MGE.high与MGE.low。接下来，分析两组在美罗培南治疗下的突变频率，作者发现MGE.high组的突变频率显著高于MGE.low与混合样本，说明了抗性更有可能出现在这个高表达MGE基因的亚群中。为了确定MGE驱动的亚群是否为MGH66所独有，作者将BacDrop应用于另一种肺炎克雷伯菌临床分离物（BIDMC35）。BIDMC35是一种耐碳青霉烯的分离物，其中碳青霉烯耐药是由于孔蛋白基因ompK36和转座子介导的b-内酰胺酶基因blaOXA-663的高水平表达。如同MGH66，作者再次观察到MGE驱动的亚群。通过分析9748个BIDMC35单细胞，作者确定了三个集群每个都由一个独特的转座子基因驱动，包括集群2由IS4321家族转座酶（195个细胞，2%），集群3由insH转座酶（146个细胞，1.5%），集群4由IS110家族转座酶（133个细胞，1.4%）。结合MGH66的结果，进一步证实了MGEs的可变表达可能是群体异质性的主要驱动因素之一。

图四：BacDrop揭示了主要由MGE驱动的群体内异质性

最后，最重要的就是确定一个受干扰的群体是否可能具有异质性的动态转录反应，作者分析了不同抗生素暴露后的单细胞反应。尽管环丙沙星或庆大霉素在治疗后产生了明显的转录反应，但是在单细胞水平上的反应没有明显的异质性，相比之下，美罗培南处理尽管在30 min时影响了细胞杀伤，但它只导致了最小的整体转录反应，并且其单细胞水平上表现出了异质性反应。有趣的是，美罗培南治疗下除了MGE亚群外，还诱导了4个具有不同分子反应的亚群。这些亚群簇的特征是多个通路基因的共同上调： (1)应激反应（如rseB、yidC和yhcN），(2)细胞壁/膜合成（如nlpl和lpxH），(3)细胞壁合成和DNA复制（如dnaG和ftsI），或(4)冷休克反应（如pnp和cspD）。值得注意的是，虽然CspD最初被鉴定为一种冷休克蛋白，但也有报道称它是一种DNA结合毒素，抑制DNA合成并诱导大肠杆菌持久性的形成。同时作者使用了RNA荧光原位杂交通过验证marker基因来证实了应激反应与CspD表达亚群的存在。接下来作者还使用了fluorescence cytometry验证了BacDrop，以独立量化应激反应和cspd表达簇中的细胞数量。

总体而言，在美罗培南扰动下，作者观察到由各种应激反应途径驱动的强烈异质性反应，这些反应之前在bulk RNA-seq结果中被掩盖了。并不是在所有细胞中均匀地开启特定的应激反应途径，而是在不同的亚群中诱导了不同范围的应激反应，这可能导致不同的细胞命运，如细胞裂解或抗生素耐受性。

图五：BacDrop揭示了美罗培南诱导的异质反应

使用BacDrop确定了一个美罗培南疗效降低和持留性增加的亚群

鉴于CspD在诱导大肠杆菌中耐抗生素持久性物质形成方面的作用，作者好奇是是在耐药细胞中，是GFP-low还是GFP-high的群体（cspD(MGH66:PcspD:gfp）占比高，以及是否被诱导表达cspD的细胞在美罗培南处理下能够存活。由于CspD在持留性形成而不是维持中发挥作用，预计一些细胞可能诱导表达CspD，从而使GFP表达较高，由于产生抗生素耐受性，CspD的表达则降低，导致GFP的降解从而GFP的表达降低。然而作者仍然假设与GFP-low的亚群相比，GFP-high亚群可能仍然富集于耐药细胞。在美罗培南处理30分钟后，作者进行流式分选，并将活细胞分为GFPhigh和GFP-low（图6A）亚群，并且直接分类到含和不含美罗培南的液体培养基中。由图6B可以看出，GFP-high的群体在耐药性与持留性上更加的富集。作者接下来基于全基因组测序进一步确认了这些持留性的亚群并未在基因上获得任何突变。在过表达cspD的MGH66菌株中，持留菌增加了100倍。并且基于最低抑制浓度并没有明显变化，反应了过表达CspD并未降低对抗生素的敏感性。总之这些结果表明了CspD在持留性增强亚群中起到的作用。

图六:表达cspD的簇富含持留性细胞

今天的文献讲解就给大家说到这了，纵观全文，可以看到文章是层层递进的介绍了方法、评估了性能、展示了应用，文章写法与之前发表在《Science》上的另一篇微生物单细胞方法很类似[1]。这也说明了在微生物研究方面，单细胞技术大有可为。

参考文献：

Microbial single-cell RNA sequencing by split-pool barcoding