采血后标本存放时间及温度对血浆游离DNA含量检测结果的影响

早在1948年，学者MANDEL等[1]就报道了血浆中游离DNA（cell-free DNA，cfDNA）的存在。由于其含量较少，且大多为小分子片段DNA[2]，提取较困难，在提取过程中常会丢失一部分DNA，导致检验的相对灵敏度降低，影响实验及临床结果的真实性，也由此限制了血浆cfDNA在临床诊断中的应用。最近的研究显示，肿瘤患者血浆中cfDNA的含量显著高于正常健康人群血浆中的含量，且检测出的突变基因可用于指导肿瘤的靶向治疗。关于在获取肿瘤患者的血液样本后，血液存放温度和存放时间对cfDNA检测结果是否有影响目前尚未明确。本研究拟检测采血后不同存放时间及温度下血浆中cfDNA的含量，并比较其提取效率，探讨最佳的分离处理时间，为临床上提高分离提取cfDNA的效率提供正确的指导。

DNA提取试剂盒（QIAamp Circulating Nucleic Acid Kit，德国QIAGEN公司）、DNA浓度检测试剂盒（中国上海晶抗生物公司）。DNA浓度检测仪（Qubit，美国Invitrogen公司）。

血液样本采自50例健康志愿者，其中男30例，女20例，年龄25~65岁，平均年龄43岁。抽取空腹外周静脉血至EDTA抗凝采血管（5 mL/管，7管/人），然后将其分别置于4 ℃、25 ℃，并分别存放2 h、6 h、24 h，以备后续实验。

取不同存放时间及存放温度的全血样本5 mL，室温3 000 r/min离心15 min。将离心后的上清液移至新的离心管中，再经16 000 r/min、室温条件下离心10 min，将离心后的上清液移至新的离心管中，获得血浆成分，备用。

按照DNA提取试剂盒说明书进行操作，获得cfDNA，并置于冰上，立即行cfDNA浓度测定。

采用SPSS 20.0统计软件进行统计学分析。各组之间的差异性采用单因素方差分析进行比较。P < 0.05为差异有统计学意义。

检测不同时间、不同存放温度下各组血液标本中cfDNA的浓度，结果显示，4 ℃下，存放2 h、6 h、24 h时，cfDNA的浓度均低于采血后立即检测的结果，且6 h与24 h的检测结果比较，差异也有统计学意义（P < 0.05）；25 ℃（室温）下，2 h和6 h的cfDNA浓度均低于0 h的浓度，差异均有统计学意义（均P < 0.05），但24 h cfDNA浓度却高于0 h，差异有统计学意义（P < 0.05）。同一时间段、不同温度下的检测结果显示，2 h时差异无统计学意义（P > 0.05），6 h和24 h时，则均有统计学意义（P < 0.05）。见表 1。

1948年法国学者首次发现了人类血液中存在cfDNA[1]。在多种疾病状态下，患者的血浆中都可以检测到cfDNA含量显著升高，因此，认为血浆中cfDNA是一种很有前景的疾病诊断分子标志物，且具有提取样本方便等优点。目前，关于cfDNA的研究主要集中在产前诊断[2-3]、肿瘤的早期诊断与预后判断[4-5]及感染性疾病[6-7]等领域。在疾病状态或应激条件下，cfDNA的浓度显著升高。有学者对肿瘤患者血浆中的cfDNA进行研究发现，它具有肿瘤细胞DNA的一些特征，因而认为肿瘤患者血浆中游离的DNA可能来源于脱落的肿瘤细胞、肿瘤的凋亡细胞和坏死细胞；另有学者[8]则认为cfDNA主要来源于活细胞，特别是增殖旺盛的细胞。血液中cfDNA的浓度升高不仅见于各种肿瘤患者、孕妇等细胞增殖旺盛的人群，各种老年性疾病，如心肌梗死、中风等患者的血浆中cfDNA的浓度也显著升高[9]。

由于cfDNA含量较少，提取难度大，且提取过程中存在部分丢失，存放时间长短及存放温度等都会影响cfDNA的提取量。研究者对血液中cfDNA的正常参考值范围进行了检测，检测的样本多来自正常健康人，可能由于实验样本数量的差异及样本处理和检测方法的差异，导致各研究组的结果之间也存在很大的差异。ILOEJE等[10]采集了16例健康人的外周血，利用酚-氯仿法提取血浆中的cfDNA，结果显示其含量约为（27.6±6.91）μg/mL；KOCSIS等[11]利用QIAamp试剂盒提取外周血血浆中的cfDNA，检测其含量平均值约为1.6 μg/mL；有研究[12-14]显示，cfDNA的含量均 < 15 ng/mL。然而，由于血浆中cfDNA的提取难度较大，无论用何种方法提取都会存在一定的蛋白或多糖污染，影响DNA纯度值。应用QIAamp试剂盒所提取的血浆cfDNA的纯度值OD260/OD280为1.24~1.76，也未达到1.8~2.0这一理想区间。

要利用血浆cfDNA所提供的信息来进行临床诊断及指导临床治疗，必须明确cfDNA的来源及其浓度变化的机制。研究[15]认为，血浆中cfDNA的半衰期很短，获得血液样本后应立即进行离心处理；而ANKER等[16]则认为，血浆中的cfDNA并非单独存在，而是与某种组蛋白相结合，以复合物的形式存在于血浆中，因此可以耐受多种酶的降解。

本研究检测了不同存放时间及不同存放温度下，血浆DNA浓度的变化，结果显示，4 ℃下存放2 h、6 h、24 h时，cfDNA的浓度均低于采血后立即检测的结果；25 ℃（室温）下存放2 h和6 h的cfDNA浓度均低于采血后立即检测的浓度，但24 h时的浓度却高于采血后立即检测，差异有统计学意义（P < 0.05）。同一时间段，不同温度下的检测结果显示，2 h时，4 ℃与25 ℃检测结果比较，差异无统计学意义（P > 0.05），6 h和24 h时却均有统计学差异（P < 0.05）。分析其原因可能是由于血液存放时间过长，血液释放降解酶，血浆中cfDNA极易被酶所降解，但存放24 h后，cfDNA浓度反而增高，也许是由于血液存放时间过长导致一部分血细胞破碎，破碎的血细胞可释放出一定量的DNA，而这部分DNA可能与血浆中原来存在的cfDNA共同导致检测结果升高。但这种情况下分析出来的结果可能会影响准确性及临床相关疾病的诊断与分析。

综上所述，不论是实验研究还是临床诊断，检测cfDNA都应尽量在获得血液标本后立即进行分离，采血2 h内检测可以不考虑存放温度的影响。不能立即检测者则可以先分离血浆后保存在-80 ℃冰箱中备用，来抑制降解酶的活性，保证血浆中cfDNA稳定，以防延长血液分离时间导致血浆cfDNA降解和细胞破碎释放DNA，影响后续检测结果。