RNA

精准医学时代背景下，以高通量测序（NGS）技术为代表的精准检测方法已从科研实验室走入临床病理科，并在肿瘤遗传易感检测、伴随诊断、疗效评估及预后监测等领域发挥重要作用。

和瑞基因【精准实验室大师班】旨为全国病理、肿瘤医生提供一个肿瘤病理相关的学术交流平台，分享分子病理与精准医疗相关的前沿理论和技术进展，探索NGS临床应用，从而更好地服务于临床诊治，使患者获益。

本期和瑞基因【精准实验室大师班】邀请到空军军医大学西京医院胡沛臻教授，请胡教授讲解“RNA-Capseq 助力临床融合基因检测”相关话题。

1. 融合基因与肿瘤的发生发展

基因融合或易位可能产生功能改变的嵌合蛋白，也可能重新排列基因启动子，通过激活原癌基因或抑制抑癌基因导致细胞信号通路紊乱，在肿瘤的发生过程中扮演着重要的角色。如，50多年前首次在慢性粒细胞白血病中被发现的BCR–ABL1融合，会导致酪氨酸激酶活性以及下游PI3K和MAPK信号通路的组成型激活，使细胞逃避凋亡，实现无限增殖。

除血液恶性肿瘤外，技术的进步使得基因融合也在许多实体瘤中得以发现，包括甲状腺癌、前列腺癌、肺癌、乳腺癌和肾癌等。特别是下一代测序(NGS)的出现，从根本上改变了癌症基因融合的发掘模式。在目前已报道的近10,000个基因融合中，有90%是通过NGS方法鉴定被发掘，包括DNA测序(DNA-seq)和RNA测序(RNA-seq)。通过对TCGA中代表13种肿瘤类型的4300个原发肿瘤样本的转录组数据分析发现，有7%的样本存在框内激酶融合。更重要的是，可用药的激酶融合在检测的单个癌症类型中检测到的频率为1%~9%，包括ALK、ROS1、RET、NTRKs和FGFR等。

随着精准医疗进程的深入，融合基因靶向药物种类和适应症正在不断增加。ALK和ROS1被证明是治疗非小细胞肺癌的有效靶点。此外，RET、NTRK1和BRAF重排也已在临床上成功用于靶向治疗。例如，针对NTRK融合突变的泛癌种靶药Vitrakvi（larotrectinib）已获得FDA批准；国内第一个RET抑制剂普拉提尼（BLU-667）也已获批上市。虽然携带融合基因靶点的患者比例较低，但由于癌症人群基数大，可能获益的患者数量仍然可观。因此，快速、准确、全面的鉴定融合基因谱可以为患者带来更优的医疗决策。

目前，融合基因诊断主要包括荧光原位杂交(FISH)、RT-PCR等方法。虽然这些方法灵敏度高，但通常只能检测单个融合基因的存在，诊断过程漫长、费用昂贵，且不能识别新的融合基因伴侣或解决复杂的结构重排，这也是导致假阴性结果的主要原因。与之相比，NGS检测融合具有明显优势，主要体现在：

1. 能够耐受低质量RNA样本，如FFPE RNA

2. 具有更高的灵敏度，能够应对低表达的融合基因

3. 可以一次检测多个基因，且具有发现新融合亚型的能力

4. 成本较低，患者能够承担，同时节约公共医疗资源

5. 具有良好的技术拓展性，可快速更新迭代，适应临床需求

2. 基于NGS的RNA检测技术对比

全转录组测序和靶向转录组测序是两种基于NGS的RNA-seq检测方法。

• 全转录组RNA-seq

主要应用于科研，成本较高，又可分为RNA-seq poly（A）和去核糖体RNA-seq。

1、全转录组测序-RNA-seq poly（A）

全转录组测序-RNA-seq poly（A）在对降解的RNA样本测序时，偏好覆盖转录本3’端，融合位点离3’端越远便越难检测。换言之，全转录组测序-RNA-seq poly（A）的融合基因检测灵敏度严重依赖于RNA样本的完整程度，由于其所需的样本质量耐受度低、成本高，并不适合用于个体患者的常规临床检测。

2、全转录组测序-去核糖体RNA-seq

RNA，包括编码RNA（即mRNA）和ncRNA（tRNA、rRNA、miRNA、lncRNA、circRNA）等不同类型的RNA分子。其中，核糖体RNA (rRNA) 约占RNA总量的 80%，是最多的一类RNA。

FFPE样本一般降解严重，更适用于去核糖体RNA-seq（下文简称“RD-RNA-seq”）的方法。然而，虽然这种方法可以获得更为完整的转录本， 但RD-RNA-seq测序成本较高。这主要是由于编码区数据占比较少，rRNA去除效果不稳定，同时还存在原核RNA污染的风险。所以需要很高的数据量才能获得足够的信息。

• 靶向转录组测序

主要应用于临床，只针对目标区域进行测序，与全转录组相比，是低丰度大样本量研究的“省钱王道”。在RNA-seq中有两类靶向测序方法，分别基于PCR和杂交捕获（下文简称“RNA-Capseq”）。

1、基于PCR的靶向测序

PCR靶向测序有一定的局限性，无法事先明确融合基因和断裂位点，只能检测已知融合，所以对于融合的检测都是有限的。

2、基于杂交捕获的靶向测序（RNA-Capseq）

基于杂交捕获的靶向测序具有捕获和识别新的非靶向融合伴侣的能力，可以检测新发融合，同时适用于DNA和RNA双重融合基因检测，是一种比较理想的RNA融合检测方法，抗癌管家-康爱管家，我们一起抗癌，治愈癌症不是梦。更加适合临床样本的融合基因检测。在低质量FFPE RNA样本中，RNA-Capseq对转录本的测序深度和覆盖均一性均明显优于poly（A）RNA-seq。RNA-Capseq在检测低丰度融合基因时，较全转录组具有明显的优势。

与传统的融合检测技术（如FISH、免疫组化、RT-PCR等）相比，RNA-Capseq能够在一次检测中评估数百个基因，提供高分辨率的融合基因检测，能同时识别已知和新的融合基因。虽然NGS检测流程较长，但这种多基因“宽度”可以缩短诊断时间，同时提高诊断率。

总之，RNA-Capseq检测技术具有耐受低质量RNA样本、高灵敏度、高基因通量，及Panel易于延伸拓展等优势。鉴于这些优点，RNA-Capseq越来越多地被用于融合基因的诊断。

然而，尽管RNA-Capseq的高通量特性为癌症诊断提供了更广泛的途径，但RNA检测在实际临床应用中仍具有一些挑战，多种因素或多环节的质控会导致最终无法获得RNA结果，如严重降解、文库浓度及片段特征或下机数据不合格等。

3. RNA-Capseq的挑战

为解决DNA-NGS融合检测的局限性，国外临床实践策略主要有“并行检测”和“序贯检测”两种模式，但实际操作层面上仍有诸多困难：“序贯检测”，即先进行DNA-NGS检测再进行RNA-NGS检测，不仅耗时，耽误及时治疗，还可能因为样本量不足导致后续无法进行RNA-NGS检测；“并行检测”，不仅增加了检测费用，同时也存在样本量不足的问题。

• 和瑞基因采用DNA/RNA“一管双检”，有效节约样本与周期

和瑞基因采取DNA/RNA“一管双检”，一份样本同时进行DNA/RNA共提，不会额外增加对样本的需求，与双管双检的方法相比，可有效的节约样本与周期。

提取环节：采取一管双检

1、和瑞基因采用经过优化后的核酸提取试剂盒，一份样本同时进DNA/RNA 共提

2、区别于耗费样本、时间的双管双检（并行/序贯）

优势：

1、样本需求量少，无需额外提供RNA测序样本

2、时间缩短，可同时拿到DNA/RNA测序结果

3、费用降低

4、准确度高

• capSMART-RNA，准确可靠的RNA融合检测技术

和瑞基因自主研发的capSMART-RNA采用了特殊优化的cDNA合成反应，专门针对高度降解的FFPE RNA，能有效提高FFPE样本的RNA融合检测成功率；此外，利用专门优化的RNA文库构建流程及特殊设计的探针池提供更准确可靠的基因融合检测，并且针对RNA建库，也添加了单分子条码组 (UMG)，可实现融合变异的定量和转录水平的检测。

• 和瑞基因多种优化策略，克服RNA检测挑战，90%以上成功率

和瑞基因在RNA检测性能上也做了多重的优化，使RNA整体检测成功率提高至94.15%，即可保障94%的患者实现DNA+RNA并行检测。包括：

1. 不断优化样本保存性能，保障样本中RNA完整度；

2. 优化RNA提取体系，减少提取过程中导致的RNA降解，提升提取效率；

3. 优化RNA建库流程和体系，提高建库效率；

4. 开发SV Scan专利算法，可高效灵敏进行RNA数据的深度挖掘和融合分析。

• 多因素判断融合基因的可靠性和临床价值，降低假阳性

生信分析和解读方面，和瑞基因主要通过以下四个方面来判断，

1. 通过生信流程判断融合基因序列的真实性；

2. 判断融合基因的转录方向是否正确；

3. 判断融合基因在数据库、文献中是否有相关报告，融合基因是否保留功能域；

4. 结合实验、分析、解读的优化，可以保障RNA融合检测结果精准可靠。

在多重融合检测策略支撑下，和瑞基因开发有多款肿瘤基因检测产品，可实现包括融合在内的基因融合/重排、易位的高精准检测。立足临床需求，坚持技术创新，解决融合检测难题。

目前和瑞基因不仅在组织层面实现DNA+RNA的并行检测，对于液体活检标本融合检测难题，和瑞基因持续技术创新，自主开发capSMART-RNA检测技术，抗癌管家-康爱管家，我们一起抗癌，治愈癌症不是梦。突破技术瓶颈，填补血检DNA+RNA融合双重检测空白，助力实现真正的DNA+RNA双检。

关于和瑞基因

和瑞基因是全球肿瘤基因检测行业及癌症早筛赛道的代表性企业，秉持“一切肿瘤实现早诊早治，所有患者获得精准治疗”使命，致力于为高危人群及患者提供覆盖肿瘤全病程的分子检测产品，并携手药企等产业上下游探索创新治疗手段。和瑞基因已完成双CAP认证（北京、福州）和三中心（实验、超算、研发）布局，产品涵盖肿瘤遗传易感检测、早期筛查、伴随诊断、疗效评估及预后监测，并已服务全国900余家医院、数十万名肿瘤患者及高危人群。在癌症早筛领域，和瑞基因依托原研技术体系HIFI，率先完成了肝癌早筛大规模前瞻性队列研究，在多瘤种早筛方面也取得突破性研究成果，并均已产业化落地服务广大国人。

本文转自肿瘤资讯（由“抗癌管家网站-康爱管家”转载分享）