几种蛋白质组学技术原理介绍及比较

图2 TMT实验流程图

iTRAQ（isobaric tags for relative and absolute quantitation）与TMT原理相似，都是采用不同标签对不同来源的蛋白进行标记并利用质谱检测的标签强度对含量进行相对定量。不同的是标签的类型及数量。iTRAQ最多只有10标，也就是说采用iTRAQ策略的蛋白质组学研究，一次最多只能上机10个样本，通量相对受限。而TMT最多可达16标，相对而言具有更高的通量。

图3 iTRAQ标签图示

Label-free和DIA采用非标签标记定量策略。Label-free通过比较质谱分析次数或质谱峰强度，分析不同来源样品蛋白的数量变化。该方法认为肽段在质谱中被捕获检测的频率与其在混合物中的丰度成正相关。因此，蛋白质被质谱检测的计数反映了蛋白质的丰度，通过适当的数学公式可以将质谱检测计数与蛋白质的量联系起来，从而对蛋白质进行定量。按照其原理主要分为两种，第一种spectrumcounts类的非标记方法，发展比较早，已经形成多种定量算法。其主要的原理是以MS2的鉴定结果为定量基础，各种方法的差别在于后期算法在大规模数据上的修正。第二种非标记定量的原理是以MS1为基础，计算每个肽段的信号强度在LC-MS上的积分（如Maxquant）。

图4Label_free实验流程

DIA技术融合了传统蛋白质组学“鸟枪法”（shotgun）和质谱绝对定量“金标准”选择反应监测/多反应监测（SRM/MRM）技术的优势和特点。主要采用数据非依赖采集模式（Data-independentAcquisition，DIA），结合传统的数据依赖采集模式（Data-dependentAcquisition，DDA）构建参考谱图库，通过液质联用技术（LC-MS/MS）将质谱整个全扫描范围分为若干个窗口，高速、循环地对每个窗口中的所有离子进行选择、碎裂、检测，从而无遗漏、无差异地获得样本中所有离子的全部碎片信息。将得到的数据利用主流分析软件Spectronaut，进行蛋白组学的鉴定、定量及差异蛋白分析等。具有全景式扫描、数据可回溯等优势。

图5DIA实验流程

上述蛋白质组学研究服务解决方案是当下相对来说应用最为广泛的几种方案。这几种研究策略具有不同特点。

TMT/iTRAQ:

1.分离能力强：可分离出酸/碱性蛋白，小于10KD或大于200KD的蛋白、难溶性蛋白等；

2.适用范围广：可以对任何类型的蛋白质进行鉴定，包括膜蛋白、核蛋白和胞外蛋白等；

3.高通量：可同时对多个样本进行分析，特别适用于采用多种处理方式或来自多个处理时间的样本的差异蛋白分析；

4.结果可靠：定性与定量同步进行，同时给出每一个组分的相对表达水平、分子量和丰富的结构信息；

5.自动化程度高：液质联用，自动化操作，分析速度快，分离效果好。

Label_free:

1.无需标记，操作简单；

2.不受比较样品数限制，可进行大批量的样本检测；

3.对实验操作稳定性、重复性要求高；

4.准确性较标记定量略低；

5.前处理少，更多保留样本最原始信息；

6.对于低丰度多肽的覆盖程度更高；

DIA:

1.重复性好：DIA数据完整性为98%，DDA数据完整性为49%；

2.鉴定敏感度高，能鉴定更多低丰度蛋白；

3.定量准确性高，定量准确度与MRM技术相当，CV值可达10%左右；

4.通量高，无需同位素标记；

5.数字化蛋白信息，可回溯；

6.样本量大：DIA技术可以在一次实验中同时对几十、上百例样本进行差异表达蛋白质进行分析。

表1几种蛋白质组学研究策略比较

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