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蛋白质相互作用检测

2023-07-05 12:50| 来源: 网络整理| 查看: 265

原理

CETSA(Cellular Thermal Shift Assay,细胞热转移实验)是一种检测细胞内药物与靶蛋白结合效率的实验,其原理是靶蛋白与药物分子结合时通常会变得稳定。

随着温度的升高,蛋白会发生降解;当蛋白结合药物后,相同温度下,未降解蛋白的量会提高,该复合蛋白的热熔曲线会右移。其样品来源可以是细胞,也可以是组织,检测方法主要有免疫印迹(Western blotting)和蛋白质谱(MS)。

用途

直接监测完整细胞和组织样品中蛋白质相互作用状态的功能调节,也可用于验证某一药物与靶蛋白的结合关系。

材料与仪器

HEK 293T 细胞、PBS、DMSO、PCR 管

液氮等

步骤

1、将构建好的质粒瞬时转染到 HEK 293T 细胞中进行体内细胞热移实验 (CETSA)。

2、按照制造商的方案转染 HEK 293T 细胞 8 小时,随后将细胞暴露于 DMSO 或者 elaiophylin 中 24 小时,收集细胞,用含有蛋白酶抑制剂 (1 mmol/L PMSF 或者 50×cocktail) 的 PBS 洗涤。对照细胞用相同体积的 PBS 孵育。

3、细胞培养计数后,用 PBS(含 1 mmol/L PMSF 或者 50×cocktail) 重悬至最终密度 2×107/ml。

4、然后将细胞分装于 7 根 PCR 管中,并在指定温度(37℃~67℃ 梯度)下在热循环器 (Bio-Rad, T100) 中加热 3 分钟以使蛋白质变性。

5、然后将细胞重悬于 NP40 缓冲液中,用液氮进行 3 次冻融循环。

6、4 ℃,20, 000×g 离心 20 min,收集上清。

7、往上清液中加等量的 2×SDS loading buffer,沸水灭活 10 min,取 20 μl,用 SDS-PAGE 凝胶进行 Western blotting(如果需要可切胶送公司做质谱分析)。

8、使用 GraphPad Prism 软件进行 CETSA 曲线分析,并进行达到 50% 温度 (Tm50) 值的热稳定性分析。

注意事项

第 6 步的离心需要在 4 ℃ 离心机中完成。

常见问题

在传统 Western blotting 操作过程中受跑胶,转膜,抗体孵育,显影等人工操作的影响,重复性会相对较差。建议先取少量样品跑一次预实验。

来源:丁香实验



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