【原创】最近做原核表达的几点教训和体会，与大家分享

2024-02-14 17:44| 来源: 网络整理| 查看: 265

hao疯狂跑电泳 wrote:我诱导表达一个16KD左右的蛋白,在OD600=0.6-0.8时加入诱导剂.然后诱导4-6个小时.不知道为什么会出现以下两种情况:1.诱导组和非诱导组比较,多出两条带.其中有一条与我要的大小相近,但是量并不大,另一条在30KD的地方.2.与我目的带大小相近的带与MARKER最下面带的位置相比好象显的稍微大了一点,MARKER最后一条14.4KD的带要比目的蛋白16KD的带低很多,并且与说明书上面给的图片相比,MARKER最后一条带(最下面)与倒数第二条带的距离也相对大了一些.有没有人遇到过和我一样的情况呢?MARKER的位置可以完全说明问题吗?1. SDS-PAGE检测分子量只是一个大概。如果要用SDS-PAGE准确地检测分子量（表观），Bio-Rad有一种更精确的分子量检测产品，不过我也没用过

2. 30 kD的带是不是二聚体？能否做Western检测一下。

3. 如果可能，可以用低分子量范围的marker，跑15%的胶。如果要与公司提供的图片进行比较，注意胶浓度，胶类型，running buffer的组成是否一致。

4. 可以用Plot的方法，Lg MW为纵坐标，迁移率为横坐标，算出目的蛋白的分子量。不过这也是比较粗放的。

5. 由于你的蛋白本身就比较小，所以“大概16 kD”，最好是算出准确的分子量。根据氨基酸序列来算，而不是笼统地根据氨基酸数目来算。

个人意见，供讨论

学到了很多东西，感谢版主！最近我也在做原和表达，一直不顺，想和大家交流一下：1 菌液OD值如何测得？需要一个control，我不知道该用LB还是用水。再，如何调节那个浓度旋钮。2 拍page时，胶膜打卷，lz如何处理的？3 我的菌液是1：10稀释，amp 100ug/ml。摇菌过夜后用的。200转/min，37度。试问，lz的转速和温度？4 我的蛋白100KD。做PAGE时是将1ml菌液离心，弃上清。再在沉淀内加入loading buffer（含SDS）震荡后煮沸使用。5 加样前离心，Ep管上层为一种粘性物质，不易吸出也不易加入胶槽中。而如果这种物质跑出来的PAGE 就像是兰粉笔在胶面上划了一道，根本没有目的条带！lz把包涵体处理过么？6 我做过一次wb（DAB显色），结果control（空载体）显色，而应该显色的却都没有显色。很奇怪。又做质粒酶切鉴定，正确。sdimmuno wrote:最近我也在做原和表达，一直不顺，想和大家交流一下：1 菌液OD值如何测得？需要一个control，我不知道该用LB还是用水。再，如何调节那个浓度旋钮。2 拍page时，胶膜打卷，lz如何处理的？3 我的菌液是1：10稀释，amp 100ug/ml。摇菌过夜后用的。200转/min，37度。试问，lz的转速和温度？4 我的蛋白100KD。做PAGE时是将1ml菌液离心，弃上清。再在沉淀内加入loading buffer（含SDS）震荡后煮沸使用。5 加样前离心，Ep管上层为一种粘性物质，不易吸出也不易加入胶槽中。而如果这种物质跑出来的PAGE 就像是兰粉笔在胶面上划了一道，根本没有目的条带！lz把包涵体处理过么？6 我做过一次wb（DAB显色），结果control（空载体）显色，而应该显色的却都没有显色。很奇怪。又做质粒酶切鉴定，正确。

1. OD是扣除培养基空白。2. 胶膜打卷？没明白。我是扫描仪扫的。3. 我在180 rpm 37度诱导。不同的蛋白，在表达条件的优化上可以试试温度，时间等条件。4. 1 mL菌液我认为偏多。而且不知道您取的菌生长到什么浓度。200 uL菌足够了。（当然可能您煮1 mL菌但是电样时仅点小量）5. lz没有对样品进行特殊处理，就是煮样。“而如果这种物质跑出来的PAGE 就像是兰粉笔在胶面上划了一道，根本没有目的条带！”没有目的条带，是总是没有还是在这种情况下没有？没有目的条带，其它条带有没有？6. 做WB的膜是用有目的条带的胶转的吗？

我认为1：10稀释不妥，你可以将最后的菌液和转接前的一起调到同一个浓度，然后铺LB＋Amp看看单菌落数有没有显著差异。

个人意见

谢谢

1 扣除培养基空白，就是说调空白时的浓度为 02 我是用bio-Rad来扫胶的。用扫描仪扫胶是个好办法，下次试试~~3 摸条件的前提是诱导成功，所以当务之急是wb出结果！4 你是把200ul菌液离心，是不是太弱了？这周我再做一次，把图传上来。5 一条带也没有，什么也没有。就是一个块。明显和其他的上清液跑出来的band不一样。（以前做的page没留图，曾经拍过一个，效果很差。）6 wb时，我转的膜很大，应该不会有错。再做一次吧。

关于稀释的问题，为什么1：10不行？1：500太少了吧？！在16h内可以让OD600达到0.5这个水平么？1ml：500ml，太稀了吧？！如果在相当时间内达不到一个理想水平，是不是菌的活性不好？

其实，这里面有个操作问题我一直没搞懂，就是标准的测菌液浓度。

下午已经把菌摇上了，明天再试试！

测OD，要扣除培养基的本底（值）。

为什么我认为1:10不好，前面的帖子有讨论。事实上后来看到很多文献也提到了，不过没留心记下来是什么文献。

关于摸条件，在表达不出来的时候可能也要摸索不同条件。如果电泳跑得不好，你拿空白的菌（就是什么也不转的）跑个电泳看看你的整个过程有没有问题。如果电泳没问题，要看看是不是稀有密码子比较多；再有就看看蛋白是不是有毒性。

供参考，祝实验顺利。

我刚刚找到一个不错的网站搜索基因中的稀有密码子：>挺不错的，正好借花献佛帖在这里。

查询结果：< 2.0的只有一个“agg ”密码子，出现了7次；还有最后的一个终止密码子uag，=0.2。其他基本都是>5.0这个大于、小于应该就是指稀有程度吧。

可是没找到关于如何确定蛋白毒性的。lz是如何查的？AGG编码Arg，该密码子是影响比较大的。还有AUA, CUA, CCC也要注意。

另外，稀有密码子出现的位置也很重要，如果出现N端的cluster，可能导致不能表达。您可以查查相关文献。

是否毒性，可以通过在平板上比较克隆大小（与空载体对照比以及加或不加IPTG的进行比较）；也可以通过做生长曲线（处理同上）来进行比较。

Just to discuss

interleukin wrote:请问楼主：您的蛋白在哪里测序的？我在北京大学测序三次也未测出，每次原因都是N端封闭，而且是按照他们的建议制备的样品再测的。我只做了protein identification，没做N- sequencingwangr_2004 wrote:你好,我遇到一个奇怪的问题: 我想纯化的是可溶蛋白,第一次纯化的时候蛋白在洗脱液elute buffer里(蛋白浓度高的几管里)出现了白色的絮状沉淀,跑了大胶准备割胶的,但是染色出来量不够,不知道什么原因,我又摇了一升菌准备再重复一次,但是纯化时又在柱子的上方形成了白色的絮状物,柱子堵得根本过不下来,过柱之前我用了12000转离了50分钟,然后又用0.45微米的滤器过滤,我想不应该是里面的渣滓太多的原因,请高手能帮我分析下原因吧,万分感谢!!!您好，关于您这个问题我想需要更多的detail，包括蛋白的pI和你用的buffer pH；什么column，column干不干净，elution buffer是什么成分等。也许我没办法给您建议，但相信会有人能给您有用的信息你好!非常感谢你的回复! 我的目的蛋白的Theoretical pI是6.50,我用的是Novagen的His-Tag融和蛋白亲和纯化的柱子,所有的Buffer的PH都调到了7.9,其中Elute Buffer的成分是:4M 咪唑; 2M 氯化钠; 80mM Tris-Hcl,PH也调到了7.9. 关于我的柱子,一是用的新的,二是用前都已平衡好了,我想应该不是柱子的问题,也问过其它实验室做蛋白的,有的说蛋白可能变性了,有的说蛋白太多可能沉淀了,都没遇到这样的情况也不能肯定,希望能得到大家的指点,谢谢!!!lz你好，我是个新手，看到了有关OD600的空白我想说下我的试验：我用空杯子和LB(1ml＋100ul甘油，甘油用于防止细菌在测OD值的过程中沉淀而引起误差)做了对照，同样我的样品也用1ml菌液＋100ul甘油，通常情况下，空杯子做对照的时候值反而高约0.01左右。不知用那种方法准一些，请高手指点另外，我还想问下：我也在做原核表达，选用的BL21(DE3)菌珠，pGEX-4T3载体，amp抗性。蛋白表达量一直不高，而且我过夜培养（37度，180rpm）菌液抽提质粒时（博大泰克试剂盒）质粒浓度通常在100ug/ml，我把菌液诱导（37度，220rpm）到约OD＝0.4－0.6后，加氯霉素至终浓度85ug/ml，诱导过夜（37度，180rpm）后（OD=1.0）抽提质粒，浓度也只有160ug/ml，我在考虑是不是像lz所说，amp抗性的消失，造成了菌种选择压力的改变，致使无质粒的菌生长速度加快，而使质粒丢失造成的此现象，而质粒的拷贝数偏低，无质粒的菌存在又进一步影响了我的蛋白表达？wangr_2004 wrote:你好!非常感谢你的回复! 我的目的蛋白的Theoretical pI是6.50,我用的是Novagen的His-Tag融和蛋白亲和纯化的柱子,所有的Buffer的PH都调到了7.9,其中Elute Buffer的成分是:4M 咪唑; 2M 氯化钠; 80mM Tris-Hcl,PH也调到了7.9. 关于我的柱子,一是用的新的,二是用前都已平衡好了,我想应该不是柱子的问题,也问过其它实验室做蛋白的,有的说蛋白可能变性了,有的说蛋白太多可能沉淀了,都没遇到这样的情况也不能肯定,希望能得到大家的指点,谢谢!!!其它不好说，我觉得4M 咪唑应该高了点，虽然可能不是造成沉淀的原因；另外，2M NaCl是不是也高了些？请有经验的战友解答一下。

关于是否是变性的蛋白，可以用沉淀跑SDS-PAGE看看。

coolbaby7638 wrote:lz你好，我是个新手，看到了有关OD600的空白我想说下我的试验：我用空杯子和LB(1ml＋100ul甘油，甘油用于防止细菌在测OD值的过程中沉淀而引起误差)做了对照，同样我的样品也用1ml菌液＋100ul甘油，通常情况下，空杯子做对照的时候值反而高约0.01左右。不知用那种方法准一些，请高手指点您好，“通常情况下，空杯子做对照的时候值反而高约0.01左右。”没太懂这个问题。不过不管怎么样，我认为0.01 的误差不要紧的；

另外，加了甘油菌液就稀释了。从培养基里面取出菌液马上测，我认为菌体沉淀的问题可以忽略。加上每次你都是用一样的条件；而且对于菌液浓度来说，OD值并不需要非常精确。比如0.6-0.8，那么0.82或者0.84之间影响不大。

个人观点。

受教!也在做表达,很繁琐,经过两个月,摸爬滚打,好不容易做出了条带,但是还是在沉淀当中,上清中有但条带很淡,请教,高手如何提供可溶性表达.另外我们通常用1:100稀释,效果不错,感时间的时候也用1:50.如果觉得培养时间长,重用培养基悬浮沉淀,可以去内酰氨酶我一共配了5种Buffer,分别是Charge Buffer，Binding Buffer，Wash Buffer，Elute Buffer，Strip Buffer，ph都调到了7.9,也想到可能是ph的问题,但不知如何调节,更多的师兄师姐都说他们的ph7.9都做的很好,可能我的Buffer配错了,于是我干脆用别人的Buffer重复了一次,结果跟上次一样,细胞是在1*Binding Buffer里超声打碎的,然后离心取上清过柱子,样品在上清里面清澈透明挺好的,但是一加到柱子上方就出现很多白色絮状物,堵在柱床表面,样品滴的超慢,差不多1分半左右一滴,等的急死人了,柱子也是用1*Binding Buffer平衡好了的呀,如果是ph的问题的话,为什么不上柱子时挺好,而加到柱子上就出问题呢,谢谢各位的指点!!!另外，我还想问下：我也在做原核表达，选用的BL21(DE3)菌珠，pGEX-4T3载体，amp抗性。蛋白表达量一直不高，而且我过夜培养（37度，180rpm）菌液抽提质粒时（博大泰克试剂盒）质粒浓度通常在100ug/ml，我把菌液诱导（37度，220rpm）到约OD＝0.4－0.6后，加氯霉素至终浓度85ug/ml，诱导过夜（37度，180rpm）后（OD=1.0）抽提质粒，浓度也只有160ug/ml，我在考虑是不是像lz所说，amp抗性的消失，造成了菌种选择压力的改变，致使无质粒的菌生长速度加快，而使质粒丢失造成的此现象，而质粒的拷贝数偏低，无质粒的菌存在又进一步影响了我的蛋白表达？

困惑ing...

关于空白对照的问题，我个人认为，样品液和空白组差别除了目的物（菌OR、dna、ran等）外，应相同，这样才有可比性。关于甘油，我觉得还是看试验需求，如果一次测量多个样品，可以加，这样就损失了小部分但弥补了因菌沉淀而造成的误差，如果样品数量少或在测量前充分的重悬菌，就可以不加。我想请教一下我连接后pet-22b-h-2kd比pet-22b跑的还快时怎么回事啊想请各位指点一下多谢了wangr_2004 wrote:你好!非常感谢你的回复! 我的目的蛋白的Theoretical pI是6.50,我用的是Novagen的His-Tag融和蛋白亲和纯化的柱子,所有的Buffer的PH都调到了7.9,其中Elute Buffer的成分是:4M 咪唑; 2M 氯化钠; 80mM Tris-Hcl,PH也调到了7.9. 关于我的柱子,一是用的新的,二是用前都已平衡好了,我想应该不是柱子的问题,也问过其它实验室做蛋白的,有的说蛋白可能变性了,有的说蛋白太多可能沉淀了,都没遇到这样的情况也不能肯定,希望能得到大家的指点,谢谢!!!根据你所说的情况，可以判断的是目标蛋白变性了。浓度高是一个原因，最主要的是缓冲体系的变化，这在蛋白表达后的下游处理中经常出现。建议你摸一下缓冲体系，pH适当调高，盐的浓度降低一些，并且加入一些表面活性剂，如0.1% tween20或TritonX100等，另外你的纯化是具有富集作用的，可以考虑适当稀释上样的样品浓度。good luck!我有一个问题想向各位高手请教：我的蛋白表达了，但是测序公司给我的结果是第151位的碱基确实，其余碱基都对。我想知道PCR过程能导致移吗突变吗？再说移码了开放阅读框也不可能终止啊！请各位大侠赐教！fuhoujin wrote:我有一个问题想向各位高手请教：我的蛋白表达了，但是测序公司给我的结果是第151位的碱基确实，其余碱基都对。我想知道PCR过程能导致移吗突变吗？再说移码了开放阅读框也不可能终止啊！请各位大侠赐教！PCR过程能导致碱基缺失；移码了，如果导致正常（非突变）情况下之前的TAA，TGA或者TAG in frame了，就会造成提前终止。

当然测序也可能有错误。

建议您1. 检查测序公司给你的峰图；2. 检查是不是造成提前终止，如果终止了是否不能得到你现在的结果（也就是可能得到一个截短蛋白（要能根据分子量判断））；3. 是不是两头测序的？4. 重新做克隆。

真让我这种菜鸟大开眼界啊，支持我有个问题想请教一下，我原核表达一个蛋白，带his标签，分子量应该45kd左右，发现上清中似乎有差不多大小的蛋白，但沉淀中有大量30kd左右的蛋白，请问大家认为是降解掉了，还是没翻译完全？节前做的wb和sds ，结果很郁闷图是拿相机拍得大家帮忙分析啊

用的protein marker 最上面的是98kd我的目的蛋白是103kd+-

wb上的结果很奇怪，排除样品溢出。page用的是wb胶的另外一半，所以没有marker，但是位置很高。大概就在胶破了的位置上。 screen.width-333)this.width=screen.width-333" width=640 height=426 title="Click to view full IMG_0513.jpg (673 X 449)" border=0 align=absmiddle>

最近做绿色荧光蛋白（GFP）的表达和纯化，我的载体是经过改造的PET-15b(在多克隆位点加上了SmalI位点,因为我们这里大多做平端克隆），表达菌株是 BL21（DE3）。接种后37度至OD0.6-0.8后，加IPTG，37度诱导4小时。

电泳后有表达（上清和沉淀都有），但不是很大。但是纯化总是挂不上拄

请各位大侠指点一二!!!!!!!

受益匪浅!!!lqyzxg wrote:我有个问题想请教一下，我原核表达一个蛋白，带his标签，分子量应该45kd左右，发现上清中似乎有差不多大小的蛋白，但沉淀中有大量30kd左右的蛋白，请问大家认为是降解掉了，还是没翻译完全？即使不带任何质粒的BL21 DE3，沉淀中也是有蛋白的，所以还是要有对照刚开始做，有个问题，SDS loading buffer裂解全菌，超声10min，然后煮沸5min，离心后发现有大量不溶物，上清上样跑SDS-PAGE，用anti-His抗体做westernblot ，结果发现未经IPTG诱导就有很强的条带，分子量是make sense的，但是IPTG诱导后反而条带消失了，这是怎么回事？是不是蛋白在沉淀里呢？这个不溶于SDS的沉淀该怎么处理来上样跑胶阿？！谢谢！！！！！！ screen.width-333)this.width=screen.width-333" width=626 height=537 title="Click to view full 图片1.jpg (626 X 537)" border=0 align=absmiddle>

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