| 有了这一篇，再也不用问别人，WB蛋白样品制备常见问题大全！ | 您所在的位置：网站首页 › 蛋白裂解液加少了会有影响吗 › 有了这一篇，再也不用问别人，WB蛋白样品制备常见问题大全！ |
有了这一篇，再也不用问别人，WB蛋白样品制备常见问题大全！
|
一直都在做蛋白研究，但是样品制备中的小细节你都了解吗？这里为大家整理了蛋白样品制备中大大小小的常见问题，一起来学习吧！ Q：贴壁细胞收集是刮下来好还是胰酶消化好？ A：两种方式都是可行的，各有利弊。不必担心刮刀收集会刮坏细胞，胰酶消化的程度掌握不好，也会让细胞破损。胰酶消化可能会对某些膜蛋白产生影响，刮刀收集效率会略低，可根据自己的实验来选择细胞收集的方式。做总蛋白提取时，可选择直接在器皿中进行裂解，无需提前收集。 PS：使用刮刀收集时，可加入PBS帮助收取细胞。 Q：所有WB实验都用总蛋白就可以完成吗？ A：当然不是，要根据WB的实验目的来确定提取哪类蛋白，如需验证某些低丰度蛋白，或蛋白定位，或组分间表达量对比，则需要进行亚细胞结构分离或组分分离。（点这里具体学习如何确定自己该提取哪类蛋白） Q：提蛋白时要不要加蛋白酶抑制剂和磷酸酶抑制剂？ A：蛋白样品如果长期保存，或者下游实验过程较长，建议加入蛋白酶抑制剂。做磷酸化研究，一定要加入磷酸酶抑制剂！ Q：如需添加蛋白酶抑制剂该如何添加？ A：内源性蛋白酶存在于胞浆中，所以要在细胞裂解前加入抑制剂到达最佳抑制效果，提取时将抑制剂添加到裂解液中，工作浓度1X。例如100X蛋白酶抑制剂，1ml裂解液中添加10ul即可。（蛋白酶抑制剂怎么选点这里） Q：用RIPA提取总蛋白为什么会有粘稠的不可溶沉淀？是什么？如何解决？ A：产生粘稠物的主要原因是RIPA不能将所有样品全部裂解，产生的不可溶组分中主要含有核酸残团，细胞碎片（有些组织样品还含有油脂），和部分蛋白，因此RIPA提取的仅仅是可溶性蛋白，并非真正的总蛋白。 解决方案：使用柱式法蛋白提取真正意义上的总蛋白（详细了解柱式法总蛋白提取。） Q：不同时间点处理细胞，如何收集进行蛋白提取更合理？ A：最好是收集完细胞后马上进行蛋白提取。（推荐阅读：10分钟，15分钟，30分钟收一次细胞，我该什么时候提蛋白？） Q：浓度测定哪家强？ A：浓度测定方法很多，目前推荐使用兼容性较好的BCA法进行浓度测定。（点这里详细学习BCA怎么做，内含用Excel计算浓度步骤） Q：蛋白样品如何储存？ A：蛋白样品不建议久存，也不要反复冻融。下游做WB实验，建议蛋白浓度测定后，加入loading buffer煮样，煮后根据实验需要分装成小管在-80℃，下次使用前拿出小管再次煮样即可。（详细学习蛋白储存方法） Q：样品上样前怎么处理？ A：蛋白浓度测定后，建议将各个样品稀释到某一固定浓度（稀释可以PBS，水或裂解液），加入loading buffer后，在沸水中煮3-5分钟，使蛋白充分变性，也可使用PCR仪95度加热5分钟。（点这里了解为什么加loading buffer） PS：煮沸并非必须步骤，膜蛋白建议70℃或者更低温度煮。 煮后在冰上静置少许时间，进行低速离心，即可上样。 Q：组织样品含血量多可以直接提蛋白吗？ A：如组织样品中含血较多，血红蛋白可能会影响下游实验， 可以在组织样品裂解前使用红细胞裂解液（Invent cat# WA-007）进行处理后，再进行蛋白提取。
针对于蛋白样品制备，你还有哪些疑虑和问题呢？欢迎给我们给我们在下方留言，我们将在下方留言区随机抽取5位送实验室神兽“马上有条带”给你膜拜哦！当然也欢迎与我们的技术老师进一步交流关于蛋白研究的各类问题，点击下方二维码与我们联系！
|
【本文地址】
公司简介
联系我们