m6A: METTL16蛋白“催化“MAT2A发生RNA甲基化

看点：METTL16 催化 RNA-m6A 的验证方法，以及功能结构域互作的鉴定套路。

关键词：

m6A RNA甲基化：m6A（N6-methyladenosine，6-甲基腺嘌呤）是真核生物mRNA内部序列中最常见的一种甲基化修饰，同时可以功能性的调节真核生物的转录组从而影响mRNA的剪接、出核、定位、翻译和稳定。m6A RNA出现在多种重要的细胞生命过程中，如干细胞分化、生物节律等，同时也参与了多种疾病的发生，包括肿瘤、肥胖和不育等。

RNA甲基化 概念图示：

Writers：“写入”；催化RNA底物反应生成甲基化RNA产物。本研究METTL16为该类蛋白。

Reader：“读取” ；特异性读取甲基化RNA，行使生命过程功能。

Erasers：“清除”；催化甲基化RNA底物反应生成脱甲基化RNA产物。

m6A RNA甲基化：m6A（N6-methyladenosine，6-甲基腺嘌呤）是真核生物mRNA内部序列中最常见的一种甲基化修饰，同时可以功能性的调节真核生物的转录组从而影响mRNA的剪接、出核、定位、翻译和稳定。m6A RNA出现在多种重要的细胞生命过程中，如干细胞分化、生物节律等，同时也参与了多种疾病的发生，包括肿瘤、肥胖和不育等。

RNA甲基化 概念图示：

Writers：“写入”；催化RNA底物反应生成甲基化RNA产物。本研究METTL16为该类蛋白。

Reader：“读取” ；特异性读取甲基化RNA，行使生命过程功能。

Erasers：“清除”；催化甲基化RNA底物反应生成脱甲基化RNA产物。

结论：从生物化学，分子生物学，结构生物学，生物信息学，进化生物学等多学科多角度； 采用（1）同位素标记技术，（2）体外分子互作的PAGE检测， （3）重组蛋白制备及突变分析，（4） 蛋白结构分析构拟与三维可视，（5）RNA 二级结构预测 ，（6）蛋白多重序列比分析结构域，（7）分子进化分析等技术；论证了METTL16具有结合RNA并催化RNA甲基化的结构域。

结果展示：

A：上图为人源METTL16蛋白质结构域示意图。下图为鉴定RNA与蛋白质的结合的“紫外线交联大分子PAGE检测”：本研究目的是为了鉴定：全长METTL16蛋白与MAT2A 1号发卡RNA基序（Motif）的结合。

结构域介绍：

RBD：Ras bindng Domain；Ras蛋白结合结构域。

MTase：Methyltransferase；甲基转移酶结构域。

VCR1：VCR2：vertebrate conserved region；脊椎动物高度保守区，功能未知。

FL：Full length；蛋白质的全长氨基酸序列。

deltaN: 上图METTL16-Core核心蛋白质缺失了N端肽端的 43-291段氨基酸序列。

32P-a-UTP-Labling RNA：通过含有同位素磷32的UTP标记的RNA。

UV crossing 254nm：通过波长为254nm的紫外线进行RNA与蛋白质的交联。

结构域介绍：

RBD：Ras bindng Domain；Ras蛋白结合结构域。

MTase：Methyltransferase；甲基转移酶结构域。

VCR1：VCR2：vertebrate conserved region；脊椎动物高度保守区，功能未知。

FL：Full length；蛋白质的全长氨基酸序列。

deltaN: 上图METTL16-Core核心蛋白质缺失了N端肽端的 43-291段氨基酸序列。

32P-a-UTP-Labling RNA：通过含有同位素磷32的UTP标记的RNA。

UV crossing 254nm：通过波长为254nm的紫外线进行RNA与蛋白质的交联。

附：补充材料中，通过同位素碳14标记RNA甲基化后，进行图A实验，鉴定了METTL16核心序列与甲基化RNA的结合情况。

结论：人源METTL16蛋白质的核心序列，也就是MTase结构域不仅可以特异结合MAT2A的RNA发卡结构，也能结合甲基化的MAT2A的RNA发卡结构。

B：METTL16核心结构域MTase的三维结构图。标记出的位点为带正电的氨基酸残基，这些残基共同创造了结合RNA的“壕沟”结构。

C：METTL16核心结构域MTase中，蓝色表示：带正电的表面；虚线表示：结合RNA的“壕沟”，这里也是发生RNA甲基化反应的位置，但不在N端区。

D：上图为METTL16蛋白N端40个氨基酸序列的示意图，以及突变体MUT1、MUT2、MUT3的构建方式。下图为体外甲基化RNA与蛋白互作鉴定。定量野生型与点突变型METTL16核心蛋白结构域与甲基化RNA底物RNA7的互作，同位素碳14为标记RNA甲基化的标记。

* 红色表示突变位点，主要是带正电的氨基酸。

* 突变原则是：将带正电的残基突变中性的氨基酸，或是Alpha螺旋构造模块。

* K5A表示：METTL16 氨基酸序列5位的赖氨酸K经过改构为丙氨酸A。

* 红色表示突变位点，主要是带正电的氨基酸。

* 突变原则是：将带正电的残基突变中性的氨基酸，或是Alpha螺旋构造模块。

* K5A表示：METTL16 氨基酸序列5位的赖氨酸K经过改构为丙氨酸A。

结论：METTL16催化RNA甲基化的核心残基为：5位赖氨酸，10位精氨酸，185位及186位脯氨酸，这4个位点氨基酸突变后进行验证，胶图反映METTL16与底物甲基化RNA的结合显著减少。

E：通过不同构象的RNA分子与突变体蛋白，体外甲基化RNA与蛋白互作鉴定。

结论：METTL16-核心结构域N端与RNA结合，其RNA结合核心区域（RNA Motif)为环化的RNA6的Loop环状区，有趣的是，该蛋白核心结构域N端不与线性化RNA Motif结合。

F：METTL16蛋白与RNA6基序Motif结合的剂量梯度鉴定。佐证了图E的结果。

G：METTL16氨基酸序列的同源物的多重序列比对：表征催化结构域的氨基酸残基的保守性。红色为保守氨基酸，重要的氨基酸位点，对RNA甲基化起到关键作用。

材料来源：Molecule Cell

Methylation of Structured RNA by the m6A Writer METTL16 Is Essential for Mouse Embryonic Development

Fig2 The N-Terminal Module of Human METTL16 Is Required for Substrate RNA Binding

原文链接为该文：

- Structure of the METTL16 m6 A writer domain with a unique N-terminal module.

- N-terminal module of METTL16 is essential for charge-based binding to RNA.

- METTL16 preferentially methylates adenosines within structured RNAs.

- Regulation of Mat2a mRNA by Mettl16 is essential for mouse embryonic development.

- RNA甲基化“写入”机制蛋白METTL16的特定的N端结构域。

- METTL16的特定的N端结构域对RNA的结合很重要。

- METTL16 特异地甲基化特定结构的RNA分子。

- 在小鼠的胚胎发育过程中，Mat2a mRNA被Mettl16甲基化的调控至关重要。

（Mat2a Mettl16：首字母大写其他字母小写表示“ 小鼠基因”，全部字母大写表示“人类基因”。）

- Structure of the METTL16 m6 A writer domain with a unique N-terminal module.

- N-terminal module of METTL16 is essential for charge-based binding to RNA.

- METTL16 preferentially methylates adenosines within structured RNAs.

- Regulation of Mat2a mRNA by Mettl16 is essential for mouse embryonic development.

- RNA甲基化“写入”机制蛋白METTL16的特定的N端结构域。

- METTL16的特定的N端结构域对RNA的结合很重要。

- METTL16 特异地甲基化特定结构的RNA分子。

- 在小鼠的胚胎发育过程中，Mat2a mRNA被Mettl16甲基化的调控至关重要。

（Mat2a Mettl16：首字母大写其他字母小写表示“ 小鼠基因”，全部字母大写表示“人类基因”。）返回搜狐，查看更多

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