显微镜中常见荧光蛋白的光谱图及特性

1960年代初绿色荧光蛋白的发现终预示着细胞生物学的新纪元，它使研究人员能够应用分子克隆方法，将荧光团部分融合到各种蛋白质和酶靶标上，从而监测生命系统中的细胞过程。使用光学显微镜和相关方法。结合宽屏荧光和共聚焦显微镜的新技术进展，包括超快低照度数码相机和多轨激光控制系统，绿色荧光蛋白及其变色遗传衍生物已在成千上万的活细胞成像实验中证明了其宝贵的服务价值。 。

Osamu Shimomura和Frank Johnson于1961年在华盛顿大学星期五港口实验室工作，他们首先从维多利亚水母水母中分离出一种钙依赖性生物发光蛋白，他们将其命名为水母发光蛋白。在分离过程中，观察到第二种蛋白缺乏水母发光蛋白的发蓝色光的生物发光特性，但是当用紫外线照射时能够产生绿色荧光。由于这种特性，该蛋白质终被冠以绿色荧光蛋白（GFP）的俗称）。在接下来的二十年中，研究人员确定了水母发光蛋白和绿色荧光蛋白在水母的光器官中共同起作用，将钙诱导的发光信号转换为该物种的绿色荧光特征。

尽管绿色荧光蛋白的基因是在1992年克隆的，但直到几年后，当融合产物用于追踪细菌和线虫中的基因表达时，才意识到了作为分子探针的大潜力。自从这些早期研究以来，绿色荧光蛋白已被工程化以产生大量各种颜色的突变体，融合蛋白和被广泛称为荧光蛋白的生物传感器。已经鉴定并分离了来自其他物种的荧光蛋白，从而进一步扩展了调色板。随着荧光蛋白技术的飞速发展，这种遗传编码的荧光团在除简单跟踪活细胞中已标记生物分子之外的广泛应用中的实用性现已广为人知。

在示出的图1是在活使用靶向于亚细胞（细胞器）的位置的融合产物的细胞多种荧光蛋白标记的两个示例。图1（a）所示的负鼠肾皮质近端小管上皮细胞（OK线）用融合了肽信号的荧光蛋白变体混合物转染，该肽信号介导转运至核（线粒体青色荧光蛋白；ECFP）（DsRed荧光蛋白；DsRed2FP）或微管网络（增强的绿色荧光蛋白；EGFP）。由人宫颈腺癌上皮细胞（HeLa线）在图1（b）中描述。将HeLa细胞与融合至青色（mTurquoise）和黄色（mVenus）荧光蛋白编码序列（分别为高尔基复合体和细胞核）以及“水果”蛋白mCherry的亚细胞定位载体共转染线粒体网络

绿色荧光蛋白及其突变的等位基因形式，蓝色，青色和黄色荧光蛋白用于构建荧光嵌合蛋白，在用工程化载体转染后可以在活细胞，组织和整个生物体中表达。红色荧光蛋白已从包括珊瑚礁生物在内的其他物种中分离出来，并且同样有用。荧光蛋白技术避免了纯化，标记和将标记蛋白引入细胞的问题，也避免了产生针对表面或内部抗原的特异性抗体的问题。

值得欣赏的绿色荧光蛋白重要的方面是，整个27千道尔顿的天然肽结构对于开发和维持其荧光至关重要。值得注意的是，原则荧光团与相邻氨基酸的三联体衍生的：丝氨酸，酪氨酸和甘氨酸残基在位置65，66，和67（称为Ser65，Tyr66，和Gly67 ;参见图2）。尽管这种简单的氨基酸基序通常在整个自然界中都可以找到，但通常不会导致荧光。荧光蛋白的独特之处在于该肽三联体的位置位于由11个β组成稳定的桶状结构的中心张折叠成管。

在绿色荧光蛋白中心的疏水环境中，Ser65的羧基碳与Gly67的氨基氮发生反应，导致形成咪唑啉-5-酮杂环氮环系统（如图2所示）。进一步的氧化导致咪唑啉环与Tyr66结合并导致荧光物质成熟。重要的是要注意，天然绿色荧光蛋白荧光团以两种状态存在。质子化形式占主导地位，在395纳米处具有大激发，而吸收率较低的未质子化形式在约475纳米处吸收。但是，与激发波长无关，荧光发射的大峰值波长为507纳米，尽管该峰值较宽且定义不明确。

荧光蛋白荧光团的两个主要特征对其作为探针的实用性具有重要意义。首先，绿色荧光蛋白作为荧光团的光物理性质复杂，因此该分子可以进行大量修饰。许多研究都集中在微调天然绿色荧光蛋白的荧光以提供广泛的分子探针，但是使用该蛋白作为构建荧光团的起始材料的更大的潜力和大潜力不可低估。绿色荧光蛋白的第二个重要特征是荧光高度依赖三肽荧光团周围的分子结构。

如预期的那样，绿色荧光蛋白的变性会破坏荧光，并且三肽荧光团周围残基的突变会极大地改变荧光性质。β内的氨基酸残基堆积桶稳定，这导致很高的荧光量子产率（高达80％）。由于pH，温度和变性剂（如尿素）的波动，这种紧密的蛋白质结构还赋予了对荧光变化的抵抗力。高水平的稳定性通常通过扰动荧光的绿色荧光蛋白突变而以负面的方式改变，从而导致量子产率的降低和对环境的更高敏感性。尽管可以通过其他突变克服其中一些缺陷，但是衍生的荧光蛋白通常比天然物种对环境更敏感。在设计具有遗传变异的实验时，应认真考虑这些局限性。

为了使荧光蛋白适合用于哺乳动物系统，对野生型绿色荧光蛋白进行了几种基本修饰，现在在所有常用的变体中都发现了这种修饰。一步是优化荧光在37摄氏度环境下的成熟度。野生型荧光团的成熟度在28度时有效，但是将温度提高到37度会大大降低整体成熟度并导致荧光降低。将第64位的苯丙氨酸残基（Phe64）突变为亮氨酸可改善37度荧光的成熟度，这至少等同于28度观察到的荧光。这种突变存在于来自维多利亚水母的流行的荧光蛋白品种中，但不是发现其他变体的可改善37度折叠的突变。

除了提高37度的成熟度外，优化用于哺乳动物表达的密码子使用还提高了在哺乳动物细胞中表达的绿色荧光蛋白的整体亮度。总之，已经将190多个沉默突变引入编码序列中，以增强在人组织中的表达。还通过插入缬氨酸作为第二氨基酸来引入Kozak翻译起始位点（包含核苷酸序列A / GCCAT）。这些以及各种其他改进（在下面讨论）已经为哺乳动物细胞的活细胞成像提供了有用的探针，并且对于所有当前使用的源自原始水母蛋白的荧光探针都是通用的。

已经开发了范围广泛的荧光蛋白遗传变异体，其特征在于几乎涵盖整个可见光谱的荧光发射光谱图（参见表1）。维多利亚水母绿色荧光蛋白的诱变工作产生了新的荧光探针，其颜色范围从蓝色到黄色，是生物学研究中使用广泛的体内报道分子。更长波长的荧光蛋白，发光在橙色和红色光谱区域，已经从海洋海葵，开发香菇珊瑚芨，和珊瑚礁属于类珊瑚虫。还开采了其他物种以产生具有蓝绿色，绿色，黄色，橙色和深红色荧光发射的相似蛋白质。为了提高荧光蛋白的亮度和稳定性，正在进行开发研究工作，从而提高了荧光蛋白的整体用途。

示于表1中是流行的和有用的荧光蛋白变体由几个显示属性的汇编。连同每种荧光蛋白的通用名称和/或首字母缩写，峰值吸收和发射波长（以纳米为单位），摩尔消光系数，量子产率，相对亮度和体内列出了结构关联。计算的亮度值由摩尔消光系数与量子产率的乘积除以EGFP的值得出。该列表是根据科学和商业文献资源创建的，而是代表荧光蛋白衍生物，该衍生物已在文献中引起广泛关注，并可能在研究工作中具有重要意义。此外，在受控条件下记录了表中所列和以下所示的吸收光谱和荧光发射光谱，并对其进行了归一化，仅用于比较和显示目的。在实际的荧光显微镜研究中，光谱分布和波长大值可能会因环境影响（例如pH值，离子浓度和溶剂极性）而有所不同，以及局部探针浓度的波动。因此，列出的消光系数和量子产率可能与在实验条件下实际观察到的不同。

尽管天然绿色荧光蛋白产生荧光并且稳定，但大激发光接近紫外线范围。由于紫外线需要特殊的光学考虑，并且会损坏活细胞，因此通常不适合用光学显微镜对活细胞成像。幸运的是，通过将改变65位丝氨酸的单点突变引入苏氨酸残基（S65T），绿色荧光蛋白的大激发光很容易转移到488纳米（在青色区域）。这种突变是绿色荧光蛋白流行的变体，称为增强的GFP（EGFP），可通过BD Biosciences Clontech（荧光蛋白技术的创新者之一）提供的多种载体在市场上买到。此外，可以使用为荧光素设计的常用滤光片对增强版进行成像，并且该滤光片是当前可用荧光蛋白中亮的一种。这些功能使增强型绿色荧光蛋白成为受欢迎的探针之一，并且是大多数单标记荧光蛋白实验的良好选择。使用EGFP的缺点是对pH值敏感，并且二聚化趋势较弱。

除了增强的绿色荧光蛋白外，目前在活细胞成像中还使用了其他几种变体。就光稳定性和亮度而言，其中一种可能是Emerald变体，但缺乏商业来源限制了其用途。几种来源提供了人源化的绿色荧光蛋白变体，这些变体为荧光共振能量转移（FRET）实验提供了优势。取代亮氨酸（F64L;GFP2）的第64位的苯丙氨酸残基产生了一个突变体，该突变体保留了400纳米的激发峰，可以偶联为增强的黄色荧光蛋白的有效伴侣。S65C的变体商业上已经引入了在474纳米处具有峰值激发的突变（通常用半胱氨酸代替丝氨酸）作为增强的蓝色荧光蛋白比红移的增强绿色版本更合适的FRET伴侣。一种名为ZsGreen1且在505纳米处具有发射峰的珊瑚礁珊瑚蛋白已被引入，以替代增强型绿色荧光蛋白。当在哺乳动物细胞中表达时，ZsGreen1相对于EGFP明亮，但在产生融合突变体方面的作用有限，并且与其他珊瑚礁蛋白类似，具有形成四聚体的趋势。

在绿色荧光蛋白的晶体结构显示苏氨酸残基203（Thr203）位于发色团附近之后，启动了黄色荧光蛋白家族。引入该残基突变为酪氨酸以稳定发色团的激发态偶极矩，并导致激发和发射光谱向更长的波长偏移20纳米。进一步的改进导致增强型黄色荧光蛋白（EYFP），它是明亮，使用广泛的荧光蛋白之一。增强的黄色荧光蛋白的亮度和荧光发射光谱相结合，使该探针成为荧光显微镜中多色成像实验的极佳候选者。与增强的蓝绿色荧光蛋白（ECFP）或GFP2配对时，增强的黄色荧光蛋白也可用于能量转移实验。但是，黄色荧光蛋白存在一些问题，因为它对酸性pH值敏感，并且在pH 6.5时丧失了约50％的荧光。此外，与绿色荧光蛋白相比，EYFP还被证明对氯离子和光漂白剂更敏感。

用于黄色发射的荧光蛋白结构的持续发展已经解决了黄色探针的一些问题。相对于EYFP，黄色荧光蛋白的黄水晶变体明亮，并且已被证明对光漂白，酸性pH和其他环境影响具有更高的抵抗力。另一种名为维纳斯（Venus）的衍生物是成熟的，也是迄今为止开发的亮的黄色变体之一。从Zoanthus克隆的珊瑚蛋白ZsYellow1印度洋和太平洋的本地物种，产生真正的黄光发射，是多色应用的理想选择。像ZsGreen1一样，这种衍生物不如EYFP那样可用于创建融合蛋白，并且具有形成四聚体的趋势。许多更健壮的黄色荧光蛋白变体对于FRET研究中的定量结果重要，也可能对其他研究有用。

在示出的图3是许多常用的和市售的荧光蛋白质，其跨越从青色可见光谱内的远红的吸收和发射光谱曲线。来自维多利亚水母的水母变体，包括增强的蓝绿色，绿色和黄色荧光蛋白，显示出从425到525纳米的峰值发射波长。源自珊瑚礁的荧光蛋白DsRed2和HcRed1（如下所述）发出更长的波长，但在哺乳动物细胞中存在寡聚产物。

绿色荧光蛋白的蓝色和青色变体来自天然荧光团中第66位（Tyr66）酪氨酸残基的直接修饰（见图2）。该氨基酸向组氨酸的转化导致大波长为450纳米的蓝色发射，而向色胺的转化导致在480纳米附近的主要荧光峰以及在500纳米附近的肩峰。两种探针都仅具有弱荧光性，并且需要进行二次突变以提高折叠效率和总体亮度。即使进行了修改，此类荧光蛋白的增强版本（EBFP和ECFP）的亮度只有增强型绿色荧光蛋白的25％到40％。另外，在不常用的光谱区域中激发蓝色和青色荧光蛋白有效，因此需要专门的滤光片组和激光源。

尽管存在蓝色和青色荧光蛋白的缺点，但对多色标记和FRET的广泛兴趣已使其在许多研究中的应用普及。对于增强的蓝绿色荧光蛋白而言尤其如此，可以通过氩离子激光（使用457纳米光谱线）在峰下进行激发，并且与蓝色衍生物相比，对光漂白的抵抗力更高。与其他荧光蛋白相反，在可见光谱的蓝色区域设计更好的探针的兴趣不高，此类荧光团的大部分开发研究都集中在青色变体上。

在已引入的改进的青色荧光蛋白中，AmCyan1和称为Cerulean的增强型青色变体显示出大的希望。源自珊瑚礁Anemonia majano，与哺乳动物表达过程中增强的蓝绿色荧光蛋白相比，AmCyan1荧光蛋白变体已通过人密码子进行了优化，以产生较高的相对亮度水平和对光漂白的抵抗力。不利的一面是，与大多数其他珊瑚礁蛋白类似，该探针具有形成四聚体的趋势。Cerulean荧光探针是通过对增强的蓝绿色荧光蛋白进行定点诱变而开发的，以产生更高的消光系数和提高的量子产率。蔚蓝是至少2倍亮度比增强型青色荧光蛋白，并已被证明当与黄色发射荧光蛋白，如金星（见耦合到显著增加信噪比图4），在FRET调查。

荧光蛋白开发的主要目标已成为构建等于或超过增强型绿色荧光蛋白特性的红色发光衍生物。合适的红色荧光蛋白的优点包括与现有的共焦和宽视场显微镜（及其滤光片组）的潜在兼容性，以及对整个动物成像的能力增强，这对红光更为透明。由于从黄色光谱范围之外的维多利亚水母水母绿色荧光蛋白构建的红移突变体已被证明在很大程度上是不成功的，因此研究人员将他们的搜索转向了热带珊瑚礁。

一个被广泛利用的珊瑚来源的荧光蛋白来源于条纹Disc（Discosoma striata），通常被称为DsRed。一旦完全成熟，DsRed的荧光发射光谱会在583纳米处出现一个峰，而激发光谱在558纳米处有一个主峰，而在500纳米附近有一个小峰。但是，使用DsRed会带来一些问题。DsRed荧光的成熟缓慢发生，并在荧光发射处于绿色区域时持续一定时间。称为绿色状态，由于光谱重叠，这种伪影已被证明对其他绿色荧光蛋白的多重标记实验有问题。此外，DsRed是专性四聚体，可以在活细胞中形成大的蛋白质聚集体。尽管这些特征对于将DsRed用作基因表达的报告子来说是无关紧要的，但DsRed作为表位标签的用途受到严重限制。与已经成功用于标记数百种蛋白质的水母荧光蛋白相反，DsRed偶联物被证明不太成功，并且通常具有毒性。

DsRed荧光蛋白的一些问题已通过诱变得以克服。第二代DsRed，称为DsRed2，在肽氨基末端包含多个突变，可防止蛋白质聚集物形成并降低毒性。此外，通过这些修改，荧光团的成熟时间减少了。DsRed2蛋白仍形成四聚体，但由于成熟更快，因此在多个标记实验中与绿色荧光蛋白更兼容。第三代DsRed突变体已经实现了成熟时间的进一步减少，就峰值细胞荧光而言，该突变体还显示出更高的亮度水平。DsRed-Express发出的红色荧光在表达后一个小时内可以观察到DsRed2，而DsRed2大约需要6个小时。已经开发出一种酵母优化的变种，称为RedStar，它还具有提高的成熟速率和增加的亮度。DsRed-Express和RedStar中绿色状态的存在，这使得这些荧光蛋白成为橙红色光谱区域中进行多重标记实验的选择。由于这些探针仍为专性四聚体，因此不是标记蛋白质的选择。

已从珊瑚礁生物中分离出了几种显示出可观前景的其他红色荧光蛋白。HcRed1是适用于哺乳动物的一种，它是从香菇中分离得到的。现已上市。HcRed1源自非荧光色蛋白，该蛋白通过诱变吸收红光以产生弱荧光专性二聚体，该二聚体的大吸收量为588纳米，大发射量为618纳米。尽管该蛋白质的荧光发射光谱足以与DsRed分离，但它趋于与DsRed共聚，并且亮度较差。已经产生了一种有趣的HcRed构建体，其串联包含两个分子以克服二聚化，该二聚化原则上优先发生在串联配对中以产生单体标签。但是，由于这种孪生蛋白的总体亮度尚未提高，因此对于活细胞显微镜中的常规应用来说不是一个好的选择。

在其自然状态下，大多数荧光蛋白以二聚体，四聚体或更高阶的寡聚体形式存在。同样，维多利亚水母绿色荧光蛋白被认为参与了与水母发光蛋白的四聚体复合体，但是这种现象仅在高的蛋白浓度下才能观察到，而水母荧光蛋白二聚化的趋势通常弱（解离常数大于100微摩尔）。因此，当在哺乳动物系统中表达荧光蛋白时，通常不会观察到二聚化。但是，当荧光蛋白靶向特定的细胞区室（例如质膜）时，理论上局部蛋白的浓度可以变得足够高以允许二聚化。在进行FRET实验时，这是一个特别需要关注的问题，它会产生容易被二聚化伪影损害的复杂数据集。

单体DsRed变体的构建已被证明是一项艰巨的任务。创建一代单体DsRed蛋白（称为RFP1）需要对结构进行30个以上的氨基酸改变。但是，与天然蛋白相比，该衍生物的荧光发射显着减少，光漂白快，因此其效用远低于单体绿色和黄色荧光蛋白。诱变研究工作，包括诸如体细胞超突变等新技术，正在继续寻找黄色，橙色，红色和深红色荧光蛋白变体，以进一步降低这些潜在有效的生物探针自缔合的趋势，同时推动大发射量的发展。朝向更长的波长。

尽管尚无所有标准对单个变体进行优化，但正在开发具有更高消光系数，量子产率和光稳定性的改良单体荧光蛋白。另外，专一性四聚体红色荧光蛋白的表达问题通过产生单体变体的努力得以克服，所述单体变体产生了与生物学功能更相容的衍生物。

在这方面引人注目的发展可能是通过定向诱变靶向Q66和Y67残基引入了新的收获的荧光蛋白，这些荧光蛋白来自单体红色荧光蛋白。以反射类似于荧光发射光谱图的颜色的水果命名（请参见表1和图5），这组单体荧光蛋白在560到610纳米的波长范围内显示出大值。通过迭代的体细胞超突变进一步扩展此类，产生的荧光蛋白的发射波长高达650纳米。这些新蛋白实质上填补了红移水母荧光蛋白（如金星）和珊瑚礁红色荧光蛋白之间的空白。尽管这些新的荧光蛋白中的几种缺乏许多成像实验所必需的亮度和稳定性，但它们的存在令人鼓舞，因为这表明在整个可见光谱中终会出现明亮，稳定的单体荧光蛋白。

荧光蛋白研究中有趣的进展之一是将这些探针用作分子或光学荧光笔（参见表2），这些探针由于外部光子刺激或时间的流逝而改变颜色或发射强度。例如，对天然水母肽的单点突变会产生可光激活的绿色荧光蛋白（称为PA-GFP））可以通过用400纳米范围的光照射将激发峰从紫外光转换为蓝色光。未转化的PA-GFP具有与野生型蛋白相似的激发峰（约395至400纳米）。光转换后，在488纳米处的激发峰增加大约100倍。此事件在PA-GFP的未转化和转化池之间引起了高的对比度差异，可用于跟踪细胞内分子亚群的动态。图6（a）中所示的是在细胞质中含有PA-GFP的转染的活哺乳动物细胞，在（图6（a））和之后（图6（a）（d））用405纳米蓝色二极管激光器进行光转换。

其他荧光蛋白也可以用作光学荧光笔。DsRed荧光蛋白的三光子激发（小于760纳米）能够将正常的红色荧光转换为绿色。这种作用可能是由于DsRed中红色发色团的选择性光致漂白，导致了绿色状态下可观察到的荧光。在数小时的过程中，DsRed的Timer变体从亮绿色（发射500纳米）逐渐变为亮红色（发射580纳米）。然后可以将绿色荧光与红色荧光的相对比率用于收集时间数据以进行基因表达研究。

通过诱变绿色荧光蛋白变体获得的称为PS-CFP的可光开关荧光笔已观察到在405纳米的照明下从青色荧光转变为绿色荧光（注意图6（b）和6中中心细胞的光转化） （e））。表达为单体，该探针可能在光漂白，光转化和光活化研究中有用。但是，来自PS-CFP的荧光比PA-GFP的荧光大约暗2.5倍，就光转换效率而言，它不如其他荧光笔（光转换时荧光发射的40纳米位移小于用类似探针观察到的位移）。此或相关荧光蛋白的其他诱变作用可能会在该波长范围内产生更有用的变体。

在从珊瑚和海葵物种克隆的荧光蛋白中也开发了荧光荧光笔。枫（Kaede）是一种从石质珊瑚中分离出来的荧光蛋白，在存在紫外线的情况下，可以从绿色转换为红色。与PA-GFP不同，Kaede中的荧光转换是通过吸收光谱上不同于其照明的光而发生的。不幸的是，该蛋白是专性四聚体，与PA-GFP相比，它不适合用作表位标签。另一种四聚体石珊瑚（Lobophyllia hemprichii）荧光蛋白变体，称为EosFP（请参阅表2）发出明亮的绿色荧光，当用约390纳米的紫外线照射时，该荧光会变成橙红色。在这种情况下，光谱移位是由光致修饰引起的，该修饰涉及邻近发色团的肽主链断裂。“野生型” EosFP蛋白的进一步诱变产生单体衍生物，其可用于构建融合蛋白。

第三非水母光荧光笔，所述点燃荧光蛋白（KFP1）已经从分离的非荧光色素蛋白开发Anemonia苏卡达，现在商购的（Evrogen的）。点燃的荧光蛋白在被绿光照射之前不会显示出发射。低强度光会导致短暂的红色荧光衰减几分钟（请参见图6（c）中的线粒体）。蓝光照明可立即终止点燃的荧光，从而可以严格控制荧光标记。相比之下，高强度照明会导致不可逆的点燃，并类似于PA-GFP（图6（f））。跟踪拥挤环境中的粒子运动时，精确控制荧光的功能特别有用。例如，该方法已成功用于跟踪非洲爪蟾胚胎发育中神经板细胞的命运以及PC12细胞中单个线粒体的运动。

随着光学荧光笔的发展继续，用于光学标记的荧光蛋白应向更明亮的单体变体发展，这些变体可以很容易地进行光转换并显示出多种发光颜色。结合这些进展，能够在荧光观察和区域标记的照明模式之间平稳协调的显微镜在细胞生物学实验室中将变得司空见惯。这些创新有可能在信号转导系统的时空动态方面取得重大成就。

荧光蛋白用途广泛，已成功应用于从微生物学到系统生理学的几乎所有生物学学科。这些无处不在的探针作为报告基因在培养的细胞和组织以及活体动物中进行基因表达研究有用。在活细胞中，荧光蛋白常用于跟踪蛋白质，细胞器和其他细胞区室的定位和动力学。已经开发了多种技术来构建荧光蛋白融合产物并增强其在哺乳动物和其他系统中的表达。将荧光蛋白嵌合基因序列引入细胞的主要载体是基因工程细菌质粒和病毒载体。

可以使用适当的载体（通常是质粒或病毒）瞬时或稳定地将荧光蛋白基因融合产物引入哺乳动物和其他细胞。在瞬时或临时基因转移实验中（通常称为瞬时转染）），导入宿主生物的质粒或病毒DNA不一定整合到染色体中，而是可以在细胞质中短时间表达。基因融合产物的表达通常是在转染后数小时内进行，可通过使用与荧光蛋白兼容的滤膜组通过观察荧光发射来容易地进行监测，并在将质粒DNA引入哺乳动物细胞后持续72至96小时。在许多情况下，质粒DNA可以永久状态掺入基因组中以形成稳定转化的细胞系。瞬时或稳定转染的选择取决于研究的目标。

在荧光蛋白基因转移实验中有用的基本质粒载体构型具有几个必要的组成部分。质粒必须包含编码DNA的细菌复制起点和抗生素抗性基因的原核核苷酸序列。这些元素，通常称为穿梭序列，允许质粒在细菌宿主内繁殖和选择，以产生足够量的载体用于哺乳动物转染。此外，质粒必须包含一种或多种控制信使RNA转录起始的真核遗传元件，哺乳动物多腺苷酸化信号，内含子（可选）和在哺乳动物细胞中共同选择的基因。转录元件对于哺乳动物宿主表达目的基因融合产物而言是必需的，选择基因通常是赋予包含该质粒的细胞抗性的抗生素。这些一般特征根据质粒设计而变化，并且许多载体具有适用于特定应用的多种附加成分。

图7中示出了商业上可获得的（BD Biosciences Clontech）细菌质粒衍生物的限制酶和遗传图，该细菌质粒衍生物包含与钙网蛋白（一种常驻蛋白）的内质网靶向序列融合的增强型黄色荧光蛋白的编码序列。该基因产物在易感哺乳动物细胞中的表达产生一种嵌合肽，其包含位于内质网膜网络中的EYFP，该肽专为该细胞器的荧光标记而设计。宿主载体是含有细菌复制起点的pUC高拷贝数（约500）质粒的衍生物，使其适合在专门的大肠杆菌中繁殖。株。卡那霉素抗生素基因很容易在细菌中表达，并赋予抗药性以作为选择标记。

上面介绍的EYFP载体的其他功能是人类巨细胞病毒（CMV）启动子，可在转染的人类和其他哺乳动物细胞系中驱动基因表达，以及可产生单链DNA的f1噬菌体复制起点。载体主链还包含猿猴病毒40（SV40）复制起点，在表达SV40 T抗原的哺乳动物细胞中具有活性。通过由SV40早期启动子，新霉素抗性基因（氨基糖苷3'-磷酸转移酶）和单纯疱疹病毒胸苷激酶（HSV-TK）组成的多腺苷酸信号组成的新霉素抗性盒可以选择具有抗生素G418的稳定转染子），以确保Messenger的稳定。质粒主链上存在六个独特的限制性酶切位点（参见图7），这增加了该质粒的多功能性。

成功的哺乳动物转染实验依赖于使用相对不含细菌内毒素的高质量质粒或病毒DNA载体。在天然状态下，环状质粒DNA分子表现出三级超螺旋扭曲双螺旋数倍于自身的构象。多年来，超螺旋质粒和病毒DNA纯化的选择方法是在插层剂（如溴化乙锭或碘化丙啶）存在下氯化铯密度梯度离心。该技术在设备和材料上都很昂贵，它根据浮力密度将超螺旋（质粒）DNA与线性染色体和带切口的环状DNA分离开来，从而可以收集高纯度的质粒DNA。简化的离子交换柱色谱方法（通常称为小量制备）已大大取代了繁琐且费时的离心方案，以在相对较短的时间内产生大量无内毒素的质粒DNA。

已经开发出专门的细菌突变体，称为感受态细胞，以方便且相对便宜地扩增质粒载体。该细菌含有一系列突变，使它们特别容易受到质粒复制的影响，并且已被化学渗透，可通过称为转化的过程将DNA跨膜和细胞壁转移。。转化后，细菌在质粒指示的选择抗生素存在下生长至对数期。通过离心浓缩细菌培养物，并用含有酶的碱性去污剂溶液裂解来破坏细菌培养物，以降解污染的RNA。然后将裂解物过滤并放在离子交换柱上。在使用高盐缓冲液洗脱质粒DNA之前，将不需要的物质（包括RNA，DNA和蛋白质）从色谱柱中彻底冲洗掉。酒精（异丙醇）沉淀浓缩洗脱的质粒DNA，通过离心收集，洗涤并重新溶解在缓冲液中。纯化的质粒DNA已准备好用于转染实验。

用于转染的哺乳动物细胞必须处于良好的生理状态，并且在手术过程中必须处于对数生长期。商业上已开发了多种转染试剂以优化培养细胞对质粒DNA的吸收。这些技术的范围从简单的磷酸钙沉淀到螯合脂质小泡中的质粒DNA，脂质小泡融合到细胞膜上并将内含物传递到细胞质（如图8所示）。基于脂质的技术，由于其在大量流行的细胞系中的有效性而被统称为脂质转染，已经得到了广泛的接受，现在它已成为大多数转染实验的首选方法。

尽管瞬时转染通常会导致质粒基因产物在相对较短的时间段（数天）内丢失，但稳定转染的细胞系会在连续的长期基础上（数月至数年）继续产生客体蛋白。可以使用存在于质粒主链中的抗生素标记物来选择稳定的细胞系（参见图7）。在哺乳动物细胞系中选择稳定转染子的流行的抗生素之一是抑制蛋白合成的药物G418，但是所需的剂量因每种细胞系而异。其他常见的抗生素，包括霉素B和嘌呤霉素还已经开发了用于遗传性标记的稳定细胞选择。获得稳定细胞系的有效方法是采用高效技术进行初始转染。在这方面，已证明电穿孔可产生带有线性化质粒和纯化基因的稳定转染子。电穿孔将短暂的高压脉冲施加到细胞悬液上，以诱导质膜中形成孔，随后使转染DNA进入细胞。电穿孔需要专门的设备，但是，当进行大量转染时，该技术的费用可与脂转染试剂相媲美。

当前荧光蛋白开发的重点集中在两个基本目标上。一个目标是完善和微调来自维多利亚水母的蓝色到黄色荧光蛋白的当前调色板，第二个目标是开发在可见光谱的橙色到远红色区域发射的单体荧光蛋白。朝着这些目标迈进的进展令人印象深刻，并且近红外荧光蛋白的出现并不是不可想象的。

新一代的水母变体解决了一代荧光蛋白的大多数缺陷，特别是对于黄色和绿色衍生物。寻找一种单体的，明亮的和快速成熟的红色荧光蛋白已经产生了几种新的有趣的荧光蛋白，特别是那些来自珊瑚物种的荧光蛋白。现有荧光蛋白的开发以及新技术（例如插入非天然氨基酸）将进一步扩展调色板。随着光谱分离技术的发展和普及，这些新品种将补充现有的调色板，尤其是在光谱的黄色和红色区域。

荧光探针技术的当前趋势是将发出荧光的染料的作用扩展到远红色和近红外。在哺乳动物细胞中，自发荧光和光吸收在光谱的红色端都大大降低了。因此，远红色荧光探针的开发对于厚样品和整个动物的检查将有用。考虑到荧光蛋白作为转基因系统报道分子的成功，在未来的几年中，在整个生物体中使用远红色荧光蛋白将变得越来越重要。

荧光蛋白在生物传感器工程中的大应用潜力才刚刚被意识到。生物传感器构建体的数量正在迅速增长。通过使用结构信息，这些探针的开发已提高了灵敏度，并将继续这样做。这些努力的成功无疑表明，使用适当的基于荧光蛋白的生物传感器几乎可以测量任何生物学参数。