引物修饰忙

从古至今，人们都喜欢用各种装饰、服装、化妆品把自己变得美美的。现代人也有见朋友的“最高礼仪”：洗个头，化全妆等等。

化妆能提升个人气质，而引物也可以通过各类修饰获得更多特性。今天这篇，我们就先看看荧光和淬灭修饰基团对引物的作用吧。

荧光染料

代表：6-FAM、6-HEX、6-TET、6-ROX、6-TAMRA、6-JOE、Cy3、Cy5

应用方向与染料特性：

对于核酸标记来说，FAM几乎是最常用的荧光染料，并且与多数荧光检测设备兼容。FAM标记的产品在pH低于7的溶液中荧光会降低，通常用于pH值的范围是7.5 - 8.5。

FAM在TaqMan探针、分子信标和蝎形引物中常作为荧光报告基团，广泛应用于real-time PCR；在该应用中，FAM通常与淬灭基团BHQ1搭配。

FAM还可以标记在核酸上形成杂交探针，用于原位杂交实验等。

5’端标记FAM的引物也可以作为DNA测序引物或PCR引物扩增得到荧光标记的PCR产物，应用于测序分析，基因分析（如扩增片段长度多态性，微卫星分型）等。

PS：很多人下单前会纠结FAM前面数字是5还是6，实际上6-FAM和5-FAM互为异构体，在功能上没有明显区别。5-FAM更先被合成出来，6-FAM使用的更广泛，区别在于染料基团的连接位置不一样（C5或C6）。

应用方向与染料特性：

HEX在TaqMan探针、分子信标和蝎形引物中常作为荧光报告基团，广泛应用在多种基于real-time PCR的检测实验（如SNP检测）中；在该应用中，HEX通常与淬灭基团BHQ1搭配。

HEX可以标记在核酸上形成杂交探针，用于原位杂交实验等。

5’端标记HEX的引物可用于片段分析、基因表达研究和基因分型研究等。

应用方向与染料特性：

TET在TaqMan探针、分子信标和蝎形引物中常作为荧光报告基团，广泛应用于real-time PCR；在该应用中，TET通常与淬灭基团BHQ1搭配。

TET可以标记在核酸上形成杂交探针，用于原位杂交实验等。

5’端标记TET的引物可用于片段分析、基因表达研究和基因分型研究等。

应用方向与染料特性：

ROX是一种红色的荧光标记，常作为TaqMan探针和分子信标的报告基团，广泛应用在多种基于real-time PCR的检测实验（如SNP检测）中。在该应用中，ROX通常与淬灭基团BHQ2搭配。

ROX是活化酯形式，核酸序列上面需要先添加氨基linker，才能将ROX连接到核酸上。

ROX在荧光染料家族中对光漂白有比较强的抗性，同时在比较宽的pH范围内也较稳定。

PS：在多重PCR或real-time PCR中的SYBR Green I或TaqMan探针工作时，需要稳定的基线做为对照。ROX通常用作被动参比染料对荧光强度进行标准化处理。在多重PCR中，通常选择FAM, VIC, Texas red, CY5这几种组合。

应用方向与染料特性：

TAMRA原料是NHS酯形式，核酸末端添加时需要先添加氨基linker，如果中间添加的话需要先添加氨基修饰的dT，待合成完后再将TAMRA手动添加到序列末端。

TAMRA是一种的黄橙色的荧光标记，可以有效的被BHQ2淬灭。此外，TAMRA也是一种比较常用的荧光淬灭剂，但由于自身也会发出荧光，所以会产生比较高的背景值。

TAMRA常和FAM一起构成双标探针，广泛用于TaqMan probes, Scorpion primers和Molecular Beacons中。

TAMRA标记的核酸分子作为杂交探针广泛应用于诊断试验，以及DNA、RNA、核酸蛋白复合物的结构研究等。

应用方向与染料特性：

JOE常和BHQ1一起构成双标探针，广泛用于TaqMan probes, Scorpion primers和Molecular Beacons。

应用方向与染料特性：

Cy3是可溶于水的亮橙色染料，同时有单体以及活化酯形式，作为荧光标记可以添加到核酸的两个末端或者中间。

Cy3标记的核酸广泛地用于原位杂交、DNA测序实验中。

Cy3常和BHQ2一起构成双标探针，广泛用于TaqMan probes, Scorpion primers和Molecular Beacons中。

应用方向与染料特性：

Cy5是可溶于水的红色染料，作为荧光标记可以添加到核酸的两个末端或者中间。

Cy5染料和多种荧光成像系统、荧光扫描仪和荧光读取器等兼容。Cy5很难用裸眼观察，且不适合用汞灯激发，推荐使用具有激发光和远红外检测器的共聚焦显微镜。

Cy5标记的核酸广泛地用于real-time PCR, qPCR, FRET以及荧光原位杂交实验中。

淬灭基团

使用淬灭基团的优势：1. 较低的背景荧光值（高信噪比）；2. 适宜多重实验分析（源于淬灭基团没有二级荧光）；3. 容易合成（在oligo合成完脱保护阶段，淬灭基团比较稳定）。

代表：Dabcyl、BHQ1、BHQ2

应用方向与染料特性：

Dabcyl是一种不发出荧光的淬灭基团，该基团对可见光谱范围内的蓝色到绿色荧光染料有很好的淬灭效果。

得益于拥有较高的信噪比，且在合成中可以保持相对稳定的状态，Dabcyl基团被广泛地应用于FRET probe以及分子信标中。不过，后来被开发出的BHQ系列染料具有高消光系数和宽光谱重叠，Dabcyl在大多数情况下已被BHQ系列染料替代。

应用方向与染料特性：

BHQ1是一种不发出荧光的淬灭基团，对于黄绿色以及黄色的荧光染料有很好的淬灭效果。除了可以用作核酸相关的检测外，该探针还常常被用来进行核酸结构的分析。

BHQ1作为暗淬灭团拥有较高的信噪比，易合成且结构稳定，被广泛地应用于FRET probe、TaqMan探针以及分子信标中。

应用方向与染料特性：

BHQ2对于可见光谱范围内的黄橙色的荧光染料有很好的淬灭效果。

BHQ2的特性与BHQ1相似，作为淬灭基团拥有较高的信噪比以及合成中相对稳定的优势广泛地应用于FRET探针、TaqMan探针以及分子信标中，也可以用于核酸结构的研究。

安升达拥有十余年引物合成经验，修饰种类丰富，更多的修饰请期待下次介绍咯。

修饰基团

双标探针

安升达双淬灭探针即将上线，双淬灭探针的双重保障，可有效降低本底信号，提高信噪比，是ddPCR的优质选择；同时该修饰可有效降低探针二级结构的影响，保证长链探针的使用效果；双淬灭探针在多重qPCR检测时，还可降低多通道检测中荧光信号的相互串扰。

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图片来源：沃茨基华德

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