从零开始的科研之旅之四

首先需要进行RNA样品制备，可选的方法有：

离心柱法抽提（不必去除gDNA）

传统Trizol法抽提（需要去除gDNA）

miRNA正向引物：需要分别设计

通用反向引物：5'-GTCGTATCCAGTGCAGGGT-3'   Length：19bp      Tm：59.69℃   GC%：57.89%

注意：是否采用通用引物视情况而定，正向引物与通用反向引物不会形成二聚体时才能用

U6 qPCR引物（Human）

上游引物：5'-CTCGCTTCGGCAGCACA-3'      Length：17bp

下游引物：5'-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3'      Length：20bp

一、U6的RT-PCR：

下以PrimeScript™  RT  reagent  Kit (TaKaRa RR037A)为例：

1）取200ul 的 PCR 管，根据所得每组RNA 的浓度C，每孔加入1000ng 总RNA，按公式1000ng/C计算出所需RNA 的体积x。然后按TaKaRa 公司PrimeSriptTM RT Reagent Kit 建议的20μL 反应体系说明，依次向200μL 的PCR 管内加入下列试剂：

加样结束后，移液器吹打混匀，低速离心数秒。将逆转录PCR 管放入PCR 扩增仪内，调整参数：37℃ 15min（反转录反应），85℃ 5s（反转录酶的失活反应），4℃ ∞。

反应结束后根据实验需要进行荧光定量PCR 或放入-20℃冰箱保存。

说明：此处可以选择U6下游引物作为U6的逆转录引物，注意相应地调整无酶水的体积和反应温度。

二、miRNA的RT-PCR:

1）引物稀释：

miRNA RT Primer储存液浓度：10μM

miRNA RT Primer工作液浓度：2μM

RT Primer工作液配置：5μL RT-primer储存液+45μL DEPC水

miRNA前后引物的工作液（10μM）用储存液（100μM）稀释后分装，放入-20℃冰箱保存，避免反复冻融。

2）逆转录：

下以PrimeScript™  RT  reagent  Kit (TaKaRa RR037A)为例：

1）取200ul 的 PCR 管，根据所得每组RNA 的浓度C，每孔加入1000ng 总RNA，按公式1000ng/C计算出所需RNA 的体积x。然后按TaKaRa 公司PrimeSriptTM RT Reagent Kit 建议的20μL 反应体系说明，依次向200μL 的PCR 管内加入下列试剂：

加样结束后，移液器吹打混匀，低速离心数秒。将逆转录PCR 管放入PCR 扩增仪内，调整参数：42℃ 15min（反转录反应），85℃ 5s（反转录酶的失活反应），4℃ ∞。（注意温度）

反应结束后根据实验需要进行荧光定量PCR 或放入-20℃冰箱保存。

特别说明（偷懒方法）：

如果需要检测多个miRNA，则将miRNA和U6各自分开逆转录。

如果只检测单个miRNA，可在同一个逆转录体系中同时添加U6逆转录引物和茎环逆转录引物，同时逆转录。方法如下：

1）如下以PrimeScript™  RT  reagent  Kit (TaKaRa RR037A)为例：

取200ul 的 PCR 管，根据所得每组RNA 的浓度C，每孔加入1000ng 总RNA，按公式1000ng/C计算出所需RNA 的体积x。然后按TaKaRa 公司PrimeSriptTM RT Reagent Kit 建议的20μL 反应体系说明，依次向200μL 的PCR 管内加入下列试剂：

加样结束后，移液器吹打混匀，低速离心数秒。将逆转录PCR 管放入PCR 扩增仪内，调整参数：42℃ 15min（反转录反应），85℃ 5s（反转录酶的失活反应），4℃ ∞。（注意温度）

反应结束后根据实验需要进行荧光定量PCR 或放入-20℃冰箱保存。

2）或者将U6-R替换为随机6引物，仍以PrimeScript™  RT  reagent  Kit (TaKaRa RR037A)为例：取200ul 的 PCR 管，根据所得每组RNA 的浓度C，每孔加入1000ng 总RNA，按公式1000ng/C计算出所需RNA 的体积x。然后按TaKaRa 公司PrimeSriptTM RT Reagent Kit 建议的20μL 反应体系说明，依次向200μL 的PCR 管内加入下列试剂：

加样结束后，移液器吹打混匀，低速离心数秒。将逆转录PCR 管放入PCR 扩增仪内，调整参数：42℃ 15min（反转录反应），85℃ 5s（反转录酶的失活反应），4℃ ∞。（注意温度）

反应结束后根据实验需要进行荧光定量PCR 或放入-20℃冰箱保存。