茎尖培养与去病毒技术

引 言

植物病毒病的危害性是众所周知的，它严重地影响着植物产品的质量和产量，更严重地影响一些植物商品和原种的出口，因为检疫问题十分困难和麻烦。因此，当前在生产上提出了一个极为重要的课题——植物病毒病的防治研究。

由于病毒病原是一类结构非常简单的分子生物，大部分是由核酸和蛋白质分子组成（只有极少数的病毒含有脂类和转录酶），其核酸为芯子，蛋白质亚基为外壳。对植物病毒来说，其核酸成分主要是RNA（核糖核酸）。正因为病毒的结构很简单，自己就没有一整套酶等系统来单独地进行物质代谢和能量代谢，因而只能依靠或者说借用寄主植物的一套酶系统来进行生理代谢。这样，病毒的生理代谢特点，决定了它的寄生方式是专性活物寄生。这个特点也就给防治上带来了极大的困难。所以，长期以来，人们努力探求产生无病毒植株的方法，以期克服病毒病造成的危害。

通过研究，逐步摸索到了一个较为有效的方法茎尖培养（shoot tip culture）新技术，有的也叫生长锥或顶端分生组织培养（meristem-tip culture）（F. Quak1977）。一般让0.1—0.3毫米长的茎尖培养繁殖出的幼苗，能不带病毒质粒。由于植株体内去除了病毒病原，从而防治了病害，提高了产品的质量和产量，商品的价值也相应地得到了提高。

茎尖培养去病毒的原理

通过实践证明，进行茎尖培养确能产生无病毒植株，这道理在于病毒质粒在植物体内的运输和分布的特点。病毒在植物体内的运输方式概括有两种：一种是从细胞到细胞的短距离运输；另一种是通过韧皮部和木质部，即导管和筛管等输导系统的长距离运行（Esau，K. 1961,1968）。现今了解，在病毒质粒的运输上，韧皮部更属重要。短距离或细胞间的运输，是指薄壁组织细胞间通过胞间连丝（Plasmodesma）的运输，经电镜观察已证实了这一点。这种运输方式，首先病毒必须进入敏感细胞的原生质，在寄主细胞内要发生一系列的反应，最终病毒的遗传物质（核酸）释放到细胞内，这时候病毒体作为有机体的单位就不复存在了。一旦病毒的基因组从病毒体内释放之后，就成为复制和转录的信息源，利用寄主细胞的整套设备，进行自我复制，这样必然把寄主细胞的结构与功能扰乱，于是病毒就趁机通过胞间连丝侵入邻近细胞，这里很可能不是病毒整体而是病毒核酸在转移。这种运输速度，仅有2毫米/小时，比起一般的溶质在细胞内的转移速度（1 ~ 6毫米/小时），要缓慢得多。长距离或维管束内运输，其速度高达50厘米/小时，所以一旦病毒质粒进入叶脉以后，传布速度就大大加快。近年来不少试验证明，病毒质粒可和光合作用产物一道在韧皮部的食物流中运转而传遍整个植株。例如菸草花叶病毒（TMV）在番茄上，以磨擦接种一小叶片，周身全部运行只需120小时。

至于病毒的分布，在植物体内并不均一，这种不均一的现象，早在三十多年前就被人们发现。例如番茄在近根的一段中，病毒含量很低，在根尖（包括根冠），则全然不能发现病毒。在茎中也有同样的现象，愈接近茎的顶端，病毒浓度愈低。茎尖分生组织中为什么很少存在病毒，至今有着不同的说法。五十年代，曾发现在茎尖分生组织中，由于还没有分化维管组织，使病毒不能传递，所以茎尖分生组织中不带病毒。近年来研究认为茎尖分生组织的细胞，其代谢十分旺盛，病毒与这部分细胞发生激烈的竞争（反映在病毒与染色体物质在核仁中争夺蛋白质），斗争的结果常常寄主占优势，病毒无法获得复制自己的原料，因而很多寄主植物的茎尖分生组织中无病毒。这点可以从某些分生组织细胞的形态上得到证明。当前，还有一些新的解说，认为由于茎尖分生组织细胞迅速分裂，其速率超过病毒的增殖，因而形成了无病毒区；或是生长点向上生长的速度大于病毒的运输速度；再是认为生长点的细胞没有能供给病毒运输的通道或细胞之间的胞间连丝过细，不能使病毒进入分生组织细胞。

但是，近来也有发现，茎尖分生组织内确也存在病毒质粒，这可用指示植物方法鉴定出病毒的存在，也有更直接地在电镜中观察到病毒质粒。因此，认为茎尖培养产生无病毒植株，是在培养中获得的。这是由于原来存在的病毒在培养过程中某些因子使其失活了。推测，是培养基中某些成分能抑制病毒增殖，例如在培养基中使用的生长素2、4 - D等一些成分。也可能是温度等物理因子在起作用。这些已有实验的依据，如当培养带有病毒的材料，在培养中发现能使病毒含量降低，甚至消失。这就是使愈伤组织、游离细胞或原生质体培养（T. Murashige等1972，大澤1976，山田等1979）也可能产生无病毒植株的道理。

同时，对于“去病毒”（virus free）的概念，经过近年来实践检验，已经逐步加以修正。因为所谓去病毒，并非绝对，只能局限于已经鉴定过的病毒，还可能遗留下来一些其他的病毒，甚至不知名的一些新病毒，包括类菌质体（mycoplasma like organism）和类病毒。主要问题在于残留下来的一些病毒，必须是对生产无害或者不会引起明显的病状。例如，很多花卉植物，在一种花卉上常常感染十多种病毒，经培养后得到的“去毒苗”，并非把十多种病毒全部去除，而只要在生产上无害或不表现病状，就可以推广应用。因而近年来已使用“检定苗”（virus tested）来代替“去毒苗”的概念。在繁殖过程中需要经常随机的检定（F. Quak1977）。

茎尖培养去病毒的技术

茎尖培养去病毒的技术和程序（图1）。

从原则上讲，所有茎尖都可以取材培养，一植株的顶芽或腋芽都可以适用。芽可取自大田栽培植株或室内萌发的芽。剪取2—3厘米长的壮芽，剥去其外围的老、黄叶与易去除的叶片，经表面消毒后，在无菌室内或超净工作台上，将消毒好的芽按在双筒解剖镜下，进行仔细的剥制，剥去生长锥外围的幼叶和叶原基，直至露出圆滑的生长锥。由于不同植物其生长锥的形状、大小、外围幼叶与叶原基的着生方式均有不同。（图2）。因而剥制方法也有所不同，要根据不同植物生长点与外围器官的关系熟练地掌握。剥制时最要紧的是迅速、正确。因为剥制过程在双筒解剖镜下进行，速度慢易污染，方法不正确易碰伤生长锥，而达不到培养的目的。剥制完毕后，用锋利的解剖刀，小心切取所需大小的生长锥，随即接种于适宜的培养基上进行培养。

生长锥的长短、大小与带叶原基数对于去病毒的效果以及生长锥的成活率有着密切的关系。（表1、2）。

不仅茎尖大小影响成活率，而且切割的方法不正确，也会影响愈伤组织的形成和茎的伸长（图表3）。从图表说明切割茎尖时，切口不规则，若把叶原基下部的髓部切下，对愈伤组织形成和茎的伸长明显抑制。

经过茎尖培养，只能得到数量很少的去病毒植株，因此去毒苗的增殖是应用于生产的重要环节，日本对康乃馨去毒苗的增殖，采用液体培养，一个茎尖一年中能产生100,000株幼苗。一般可与愈伤组织培养结合进行，即得到去病毒植株后，可利用器官培养形成愈伤组织，再大量繁殖幼苗（图3）。

国外工作的进展

目前，世界各国受病毒病为害的植物极多，植物病毒病的种类已超过五百多种。其中受害严重的有粮食作物，例如水稻、马铃薯、甘薯等，几乎没有一种粮食作物上无病毒病的；经济作物，例如油菜、百合、大蒜等；花卉植物，例如康乃馨、菊花、小苍兰、鸢尾、兰花、郁金香等。而且很多病毒不仅感染一种植物，同一种植物还会感染多种病毒。

鉴于植物生产上存在的问题，1952年就有法国的Morel和他的同事们，首先从感染大丽花叶病的大丽花植株上，切取其芽的顶端，长度为0.2 ~ 0.3毫米，进行无菌培养，结果获得了无病毒植株。Morel等人的研究成果，引起了世界各国科学家的极大兴趣，从而在为挽救优良品种和防治病毒病上，开辟了一条新的有效途径。由此，很多国家相继开展了这方面工作。美国于1953年已对草莓摸索无毒株的研究，并增加了繁殖数量。英国也从相同时间开始有步骤地进行了这方面的研究工作。尤其日本，虽于1957年起才注意此项研究工作，他们最先由农林水产省农事试验场为中心，用组织培养法开始研究萨摩芋、马铃薯、草莓、康乃馨、菊花等约20种患病植物的去病毒问题。而经过十年的研究，到1969年已应用于生产。以康乃馨来说，如日本静冈县、香川县试验场，1967年开始试验研究，到1970年已建立了一套生产无病毒苗的体制。又如草莓，在日本宫城、琦玉、奈良等县，1970年开始已用茎尖培养方法商品化出售无毒苗。

国际上经过二、三十年的努力，特别七十年代以后，如在百合、马铃薯、兰花菜鳞茎、块茎、球茎类以及菊花（Asjes，C. J. 等1972；M. Ishii 1972；Allen，T. C. 1972；F. C. Mellor等1977；Klesser p. J. 等1976）等许多植物已进行了茎尖培养的去病毒工作。据1978年加拿大召开的第四届国际植物组织与细胞培养会议（T. Murashige1978）资料的报道，已有30多种植物，从感染株茎尖培养得到无病毒植株。（表3）。其中很多植物已应用于生产实践，成为植物组织培养技术应用于生产的突出例子，成为当前植物组织培养领域中三大主流之一。

确实，茎尖培养技术应用于去病毒，其进展很快，它可以应用一植株的顶芽或腋芽，不损伤母株，经过培养形成的幼苗，基本上能够去除病毒（当然较大的茎尖还必须进行病毒鉴定）。但是，剥制工作必须在双筒解剖镜下操作，需要熟练的技术，且欲使去毒率高，就需剥制茎尖小，而剥制茎尖越小，其剥制难度越大，成活率也越低。至于木本植物的茎尖培养，那更是困难（综合有关茎尖培养的报道来看，灌木比乔木容易，草本比灌木容易，树龄小的材料比树龄大的容易成功。（石川 広隆1975））。尤其，茎尖培养技术尚不能去除类病毒（比病毒更小的核酸质粒病原体）（高桥，1979），因此，目前去病毒技术的发展还可以结合应用热处理培养去病毒，包括温水浸渍处理（35° ~ 50°C左右的温水浸渍数分钟或几小时）和热风处理（把盆栽植物放在35° ~ 40°C高温下，使其生长，处理后切取新芽嫁接或培养）。这样用高温处理使病毒失活，还可以应用生长锥芽接法培养去毒苗。这种方法应用于茎尖培养较困难的木本植物。首先把实生的砧木在人工培养基内达到一定大小之后，切取无病株的茎尖与砧木切断面愈合，再无菌培养可以获得去毒苗，据佐佐木1979年用柑桔生长锥做试验，成功率约10%。而且无病毒培养技术的发展，逐步又从单项技术向几种技术结合的综合化方向迈进（大泽，1980）。

从茎尖培养技术来说，不仅应用去病毒上有实用价值，而且还可以去除细菌、真菌、线虫病原，加速繁殖特别珍贵、稀有的个体，达到繁殖的目的。如梨茎尖培养再生植株的试验，证明茎尖分生组织培养技术，可以用于迅速地再生大量的梨树植株。试验认为切下的苗端将其平卧或倒置，以减少顶端优势，可以提高苗的增殖，且培养基使用液体时，苗的增殖数就更多（W. Darid Lane 1979）。又如世界上著名的兰花试管工业化生产，也主要是用的茎尖培养技术，使其产生原球茎（protocomb），原球茎在液体继代培养中，可以不断地增殖，形成大量幼苗（Murashige1974）。同时，茎尖培养还可用来研究顶端分生组织的活动和植物发育生理等的有关问题。总之，茎尖培养技术，不仅应用在去病毒上，而且应用于农业生产上，它越来越受到人们的重视。